[发明专利]利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法

权利要求书

1.一种转BT基因甘蔗的检测引物对，其序列如下所示：

F1:5’ATG GGA CGC CTT CCT GGT G 3’（SEQ ID NO：1）；

R1:5’TCC TGG AGT CGT AGT TCG GG 3’ （SEQ ID NO：2）。

2.一种转BT基因甘蔗的检测试剂盒，包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ和反应液Ⅲ，其中，

反应液Ⅰ含有0.1~0.2M NaOH、10~15%(v/v)Tween20；

反应液Ⅱ含有0.1~0.3M Tris-HCl、2~3mM EDTA (pH2.0)；

反应液Ⅲ含有0.28~0.35μM 权利要求1所述的引物对（F1、R1的摩尔浓度比为1：1）、0.2~0.3mM dNTP、3.5~4.5mM MgCl₂、0.020~0.03U /μL Taq酶和匹配的缓冲液。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，反应液Ⅱ含有0.1M Tris-HCl、2mM EDTA (pH2.0)。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，反应液Ⅲ含有0.32μM 权利要求1所述的引物对（F1、R1的摩尔浓度比为1：1）、0.25mM dNTP、4.0mM MgCl₂、0.020~0.03U /μL Taq酶和匹配的缓冲液。

5.根据权利要求2或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液含有100mM Tris-HCl (pH8.8)，500mM KCl，0.8%（v/v）乙基苯基聚乙二醇。

6.利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法，包括如下步骤：

1）取待检甘蔗根尖，压碎；

2）加入权利要求2所述的反应液Ⅰ1~2μL，矿物油4~6μL，95~98℃加热10~18分钟；

3）再加入权利要求2或3所述的反应液Ⅱ2~3μL，权利要求2或4所述的反应液Ⅲ 15~17μL，按如下程序进行PCR扩增：预变性94℃ 4min；94℃ 40s，60℃ 1min，72℃ 30s，循环35次；72℃延伸5min；

4）根据扩增结果判断待检甘蔗是否为转BT甘蔗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4）的具体操作为：将步骤3）的扩增产物在Agrose凝胶上进行电泳分离，所得的Agrose凝胶置于成象系统上进行检测。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4）的具体操作为：

（1）配制0.8-1.2%Agrose胶，加入EB替代染料3μL/100mL；

（2）上样：每个PCR管加入上样缓冲液5-8μL，混匀后在点样孔上点样8-12μL/孔；

（3）电泳：在电压4～5V/cm条件下30～40min；

（4）检测分析：在凝胶成象系统上进行观察、照相保存。