[发明专利]一种人IL-12亲和纯化层析柱、其制备方法及利用其纯化重组人IL-12的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备重组人IL-12亲和纯化层析柱的工艺、由该工艺制得的重组人IL-12亲和纯化层析柱、及用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的方法。具体地说，本发明涉及用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备抗人IL-12单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱，然后用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的工艺流程。 

背景技术

重组人白细胞介素12(IL-12)最初称作自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor，NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF)，主要是由激活的单核细胞和其他类型的细胞(树突状细胞、B细胞、中性粒细胞以及角质细胞)产生。IL-12所具备的增加NK细胞和活化T细胞的细胞毒活性、诱生IFN-γ、调节Th1细胞的发育等免疫学活性是IL-12抗肿瘤、抗病毒效应的理论基础，动物实验亦充分证实其药用价值。以此为基础，重组人IL-12(rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病的II/III期临床试验阶段。 

人IL-12是由p40和p35两个亚基通过二硫键共价连接而成异二聚体糖蛋白，其分子量约为70-75kDa，等电点为4.5-5.5，其中p35亚单位有197个氨基酸残基，含7个半胱氨酸(cys)和3个N糖基化位点，p40亚单位306个氨基酸残基，有10个半胱氨酸，4个N-糖基化位点。p35有3个分子内二硫键，p40有4个分子内二硫键，同时p35和p40之间存在一对分子间二硫键在。单独p40或p35均无生物学活性，而且游离p40可以竞争IL-12p70与IL-12受体的结合位点，从而抑制IL-12的活性。由于 人IL-12的分子的特殊性和复杂性，用原核表达系统或酵母系统进行表达时，其产品无生物学活性，通常采用昆虫或哺乳动物细胞进行表达。本课题组采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达人IL-12(见专利ZL03131567.4)。 

重组人IL-12的纯化工艺是人IL-12工业生产的重要环节，国内外多个研究组或公司均有相关专利或文献报道，例如在本研究组已公开的专利申请200410080518.7(纯化重组人白细胞介素12的方法田志刚等2004年)中采用了超滤、阴离子、阳离子、疏水、分子筛的五步工艺法进行纯化。在国内专利CN 101033254(一种纯化重组人白细胞介素12的方法浦勤等2007年)中采用了超滤、阴离子/阳离子、硫胺沉淀、阳离子/阴离子、疏水、分子筛的六步工艺法进行纯化，这两种方法相对繁琐，步骤较多。虽然国内专利ZL01133658.7(人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达及其纯化的方法孟小林等2004年)中采用亲和法纯化人IL-12，但是该过程为亲和层析一步法纯化，无样品预处理，容易污染亲和柱，而且无人IL-12聚体去除过程。此外，由于重组人IL-12纯化的困难性，目前生物公司所提供的商业重组人IL-12产品，售价往往很高，非常不利于涉及人IL-12的研究及其大规模药用生产的开展。 

本发明中采用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱，然后用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的工艺流程。该流程只需4步即可得到纯度超过95％的rhIL-12样品，可以大大缩短工作流程及时间，并提高回收率和产物的纯度。 

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种制备重组人IL-12亲和纯化层析柱的工艺，以及由该工艺制得的重组人IL-12亲和纯化层析柱。具体地说，本发明涉及用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱。本发明还涉及利用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的方法。 

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种采用亲和层析柱纯化重 组人IL-12的方法，其特征在于用抗人IL-12单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备抗体，用该抗体制备人IL-12亲和纯化层析柱，然后以该亲和纯化层析柱为基础进行纯化重组人IL-12的方法。 

本发明的一个目的是提供利用人IL-12亲和层析柱纯化重组的人IL-12的方法。具体地，所述方法包括超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤： 

a.超滤：获得含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清，选用10-30kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约10-15倍，0.22-0.45μm滤膜过滤除去不溶性微粒；