[发明专利]一种人IL-12亲和纯化层析柱、其制备方法及利用其纯化重组人IL-12的方法

权利要求书

1.一种利用抗人IL-12的单克隆抗体制备人IL-12亲和纯化层析柱的方法，所述方法包括下述步骤：

a.活化凝胶预处理：取适量的活化凝胶，用1mM HCl进行完全溶解，并用1mM HCl冲洗胶体，然后再用0.1M NaHCO₃，冲洗胶体；

b.抗rhIL-12抗体的偶联及亲和层析柱的制备：通过超滤浓缩的方法将抗rhIL-12抗体浓缩至4-5mg/ml，然后将抗rhIL-12抗体加入活化凝胶中，置4℃过夜，然后用0.1M NaHCO₃冲洗胶体，用0.1M Tris-HCl缓冲液封闭未结合的活性基团，然后用0.1M Tris-HCl缓冲液和0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液交替冲洗胶体，最后将结合抗rhIL-12抗体的胶体装柱，制备成纯化rhIL-12的亲和层析柱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a所述的活化凝胶包括CNBr活化的Sepharose 4B凝胶、CNBr活化的Sepharose 4FF、NHS活化的Sepharose 4FF等。

3.按照权利要求1或2的方法制备的人IL-12亲和纯化层析柱。

4.一种纯化重组的人IL-12的方法，所述方法包括超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤，其特征在于使用权利要求3的人IL-12亲和纯化层析柱进行亲和层析步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括下述步骤：

a.超滤：获得含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清，选用10-30kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约10-15倍，0.45μm滤膜过滤除去不溶性微粒；

b.阴离子交换层析：采用阴离子交换层析柱，20mM Tris-HCl平衡液平衡，40mM组氨酸缓冲液洗脱杂蛋白，0.25M NaCl 20mM Tris-HCl洗脱目的蛋白；

c.亲和层析：采用权利要求3的人IL-12亲和纯化层析柱纯化rhIL-12，用20mM Tris-HCl平衡液平衡，用20mM Gly-HCl缓冲液洗脱，用1M Tris将洗脱蛋白的pH调为7.0左右；和

d.分子筛：利用分子筛去除聚体蛋白，得到纯化的重组人IL-12单体。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清由培养表达重组人IL-12的CHO细胞获得。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中可用的阴离子交换层析柱包括Sepharose，Capto，Sephadex，Sephacel等为骨架，Q，QAE，DEAE为活性基团的凝胶，例如：Q-Sepharose FF，Capto Q，Q-Sepharose HP，Capto DEAE，QAE Sephadex，DEAE-Sepharose FF，DEAE Sephadex等。

8.根据权利要求4或5所述的方法，其中可用的分子筛包括Sephacryl，Superdex，Sephadex，Superose，Sepharose等为骨架的凝胶，例如：Sephacryl S-200 HR，Superdex 200，Sephadex G-100等。

9.一种利用人IL-12杂交瘤制备抗人IL-12单克隆抗体的方法，其特征在于利用裸鼠作为免疫动物，将产生抗人IL-12抗体的杂交瘤细胞注射裸鼠进行生产。

10.权利要求9的方法，其中所述产生抗人IL-12抗体的杂交瘤细胞为ATCC CRL-2382。