[发明专利]一种通过环化方式构建测序文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种通过环化方式构建测序文库的方法。

背景技术

过去几年间，第二代高通量测序技术取得了突飞猛进的发展。其中，基于连接酶来实现测序的方法具有准确率高的优点，但由于其单一读长短，限制了这类测序方法的应用。针对这种情况，近些年出现了通过构建具有特殊结构的测序文库来提高测序读长的方法，即在待测片段中插入一个或多个接头序列，从而使同一测序文库分子具有多个连接测序起始的位点，然后分别在这些不同的起始位点上进行连接测序，从而增加测序读长。这种方法的核心在于，如何实现在待测片段中定向插入一个或多个接头序列。

现有技术中是通过多次环化、酶切来实现的，其大致实现过程如下：1)将待测片段与第一接头连接，所述第一接头包含限制酶的结合位点；2)环化来自步骤1)的产物以产生第一环形多核苷酸；3)用限制酶切割第一环形多核苷酸；4)连接第二接头，所述第二接头包含限制酶的结合位点；5)环化来自步骤4)的产物以产生第二环形多核苷酸；重复步骤3)到5)以在待测片段中插入多个接头。但是该方法对待测片段的大小均有一定的要求，如果待测片段过短，将降低环化的效率，甚至不能环化，或者环化后得到的是非目标产物，从而使得测序文库构建失败。即，现有技术中构建具有特殊结构的测序文库的方法，要求用于构建测序文库的原材料(源核酸)大于150bp，而且当建库方法中还包括片段化步骤时，原材料的大小还要进一步加大，一般要求原材料与片段化产物的大小比在10∶1以上，才能保证经片段化步骤后得到的片段化产物的随机性，进而保证后续测序结果的准确性。

由上可知，现有技术在构建上述具有特殊结构的测序文库时，很大程度上局限于原材料的大小，无法对小片段核酸分子通过环化方式完成文库构建，使得现有技术的实际应用范围较窄。

因此需要一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，能够突破对原材料大小的局限性，扩大测序文库构建方法的适用范围，并能进一步保证测序文库构建过程中环化的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，旨在解决现有技术在构建测序文库时对原材料的大小具有较强的局限性，无法采用环化方式对小片段核酸分子进行测序文库构建的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法，包括下述步骤：

A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；

B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。

其中，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4，即连接组件的大小至少是核酸片段的4倍。

其中，所述连接组件的大小大于等于140bp；更优选的，所述连接组件的大小大于等于400bp。

上述任一方案中，所述连接组件包括接头和桥序列，所述接头和/或桥序列含有IIs型限制性内切酶识别位点。

其中，所述步骤A包括以下步骤：

A1.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段；

A2.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。

进一步的，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头含有IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤A1包括以下步骤：

A11.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段；

A12.利用IIs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物；

A13.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。

更进一步的，所述步骤A11包括以下步骤：

A111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加polyA尾中的至少一种；

A112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。

其中，所述步骤A2包括以下步骤：

A21.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物；

A22.利用连接酶，将相对应的切割产物连接并环化，得到第一环形分子；

所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点；

所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割。