[发明专利]具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。

背景技术

随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基因治疗载体受到人们的高度重视。目前筛选重组杆状病毒的方法有很多，诸如酵母-昆虫细胞、大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发、杆状病毒DNA线性化和体外定点酶促重组等。但是这些方法的重组效率较低、重组病毒筛选的周期较长、很难同时分离多个重组杆状病毒、基因表达的效率也很低。

发明内容

本发明的目的是提供具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。

具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行：

一、用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3.1(-)进行双酶切；

二、用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBac1进行双酶切；

三、将双酶切后的质粒pcDNA3.1(-)和质粒pFastBac1进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)；

四、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T-Vector进行连接，获得pMD-EGFP；

五、用KpnI和Xho I对重组转移载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分别进行双酶切，分别回收pFastBac1-pcDNA3.1(-)重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBac1-pcDNA3.1(-)与纯化产物EGFP进行连接，获得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；

六、pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP转化DH10Bac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以100ng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid-EGFP；

七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN-EGFP，即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建；

其中步骤四和步骤六中引物pEGFP-u序列均为5′-CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；引物pEGFP-d序列均为5′-AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3′。

本发明首次利用杆状病毒表达载体系统在OL细胞中导入并表达外源基因，拓宽了杆状病毒可转导的哺乳动物细胞范围。而且，本发明利用CellProfiler^TM软件对重组杆状病毒介导的EGFP在OL细胞中表达的数字图像进行数量分析，确定出重组杆状病毒对OL细胞的最佳转导条件与外源基因的最佳表达条件：40MOI重组杆状病毒转导细胞并添加10mM丁酸钠，转导时间为12h，培养时间为72h，表达效率最高达95.25％。因此，本发明为EGFP在哺乳动物细胞中表达的数量分析提供一种全新、科学和准确的方法，填补了国内外该领域的空白。

附图说明

图1为具体实施方式一中重组杆状病毒CN-EGFP的转导时间及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表示72h，■表示48h，◆表示24h；

图2为具体实施方式一中转导时间及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图；

图3为具体实施方式一中转导时间及培养时间对EGFP最高表达强度的影响的图；

图4为具体实施方式一中感染复数及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表示72h，■表示48h，◆表示24h；

图5为具体实施方式一中感染复数及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图；

图6为具体实施方式一中感染复数及培养时间对EGFP最高表达强度的影响的图；

图7为具体实施方式一中丁酸钠浓度及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表示72h，■表示48h，◆表示24h；

图8为具体实施方式一中丁酸钠浓度及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图；