[发明专利]具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法

权利要求书

1.具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行：

一、用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3.1(-)进行双酶切；

二、用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBac1进行双酶切；

三、将双酶切后的质粒pcDNA3.1(-)和质粒pFastBac1进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)；

四、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T-Vector进行连接，获得pMD-EGFP；

五、用Kpn I和Xho I对重组转移载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分别进行双酶切，分别回收pFastBac1-pcDNA3.1(-)重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBac1-pcDNA3.1(-)与纯化产物EGFP进行连接，获得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；

六、pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP转化DH10Bac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以100ng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid-EGFP；

七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN-EGFP，即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建；

其中步骤四和步骤六中引物pEGFP-u序列均为5′-CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；引物pEGFP-d序列均为5′-AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3′。

2.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤一中用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3.1(-)进行双酶切的体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。

3.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤二中用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBac1进行双酶切的步骤如下：先用SnaB I单酶切，酶切体系如下：

37℃水浴作用2h，酶切结束后加入5μL醋酸钠溶液3mol/L和50μL异丙醇沉淀DNA，再用体积浓度为70％的乙醇洗一遍，用42.5μL ddH₂0溶解，再用Hpa I进行酶切，酶切体系如下：

37℃水浴作用2h。

4.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下：

连接反应条件为16℃连接过夜。

5.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤四中PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30s、55℃30s、72℃1min循环40次，最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中用KpnI和Xho I对重组转移载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)进行双酶切的体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。

7.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中用KpnI和Xho I对pMD-EGFP进行双酶切的体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。

8.根据权利要求1所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中连接的体系如下：

连接反应条件为16℃连接过夜。