[发明专利]HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

背景技术

新城疫(ND)是由副粘病毒科的新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类致死性传染病，是危害我国畜牧业的A类疾病之一。目前对新城疫的防治，普遍使用的是驯化或灭活的病原体制备的病毒疫苗，这些疫苗成本高、效价不稳定、具有一定毒性，并且新城疫病毒也经常出现新变种，致使现有疫苗易失效。因而，研制新型的基因工程疫苗具有重大意义。F蛋白是新城疫病毒主要结构蛋白之一，它能够诱导机体产生中和性抗体，在机体免疫中发挥重要作用。因此，以F基因为目的基因，利用基因重组技术研制新型疫苗成为国内外关注与研究的热点。

发明内容

本发明是要解决目前新城疫的病毒疫苗存在成本高、效价不稳定、具有一定毒性，并且新城疫病毒也经常出现新变种，致使现有疫苗易失效的问题，提供HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。

HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：

一、以质粒pNDV-F-T为模板，YL1和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F，获得HA-F片段；

二、质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行Sal I单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；

三、用T4连接酶将HA-F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL-LM、pYL-LM-ITRs、pYL-LM(-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs和pYL-SD(-)；

四、将六种重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL；

五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒vYL-LM、vYL-LM-ITRs、vYL-LM(-)、vYL-SD、vYL-SD-ITRs和vYL-SD，即完成HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建；

其中步骤一中引物YL1序列为5’-ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA-3’；引物YL2序列为5’-CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3’。

本发明通过构建了重组转移载体pYL-LM、pYL-LM-ITRs、pYL-LM(-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs和pYL-SD(-)，利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1内表达HA-F抗原蛋白。利用SDS-PAG与Western blot分析鉴定HA-F蛋白的抗原性，并比较含不同启动子和调控元件的重组转移质粒表达HA-F蛋白的差异。从而确定了重杆状病毒表达载体表达HA-NDV-F蛋白的强度，为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫的病毒疫苗成本可有效降低，效价稳定、无毒性，且避免了疫苗失效的问题。

附图说明

图1为具体实施方式一步骤三中六种重组转移载体构建的流程图；

图2为具体实施方式一中SDS-PAGE鉴定HA-F蛋白的表达的电泳图，其中泳道1-6依次表示vYL-LM、vYL-LM-I、vYL-SD、vYL-SD-I、vYL-LM(-)和vYL-SD(-)。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。