[发明专利]HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

权利要求书

1.HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：

一、以质粒pNDV-F-T为模板，YL1和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F，获得HA-F片段；

二、质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行Sal I单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；

三、用T4连接酶将HA-F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL-LM、pYL-LM-ITRs、pYL-LM(-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs和pYL-SD(-)；

四、将六种重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL；

五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒vYL-LM、vYL-LM-ITRs、vYL-LM(-)、vYL-SD、vYL-SD-ITRs和vYL-SD，即完成HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建；

其中步骤一中引物YL1序列为5’-ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA-3’；引物YL2序列为5’-CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3’。

2.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：98℃变性4min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中目的片段的TA克隆的反应体系为25μL，由下列成分组成：

目的片段的TA克隆条件为72℃反应15分钟。

4.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中连接的体系为5μL，由下列成分组成：

连接反应条件为16℃连接过夜。

5.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F的体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。

6.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行Sal I单酶切的体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。

7.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中去磷酸化处理的体系如下：

去磷酸化处理的条件为37℃水浴30min后，50℃水浴15min。

8.根据权利要求1所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下：

连接反应条件为16℃连接过夜。