[发明专利]一种规模化扩增骨髓间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地；本发明涉及一种规模化制备骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

存在于骨髓中的骨髓间充质干细胞(bone marrow Mesenchymal Stem Cells，bmMSCs)是一种成体干细胞，具有多向分化潜能，可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等。由于可以进行自体移植，因此成为近年来的研究热点。bmMSCs取材方便，易于体外扩增并长期保持多分化潜能，可进行自体移植而不存在组织配型和免疫排斥，被认为是组织工程中最佳的种子细胞。

骨髓间充质干细胞用于临床、组织工程需要大量的细胞，但是从骨髓中获取的干细胞数量有限，不能满足于组织工程所需的细胞量。由于骨髓间充质干细胞需要贴壁生长，实验室使用培养瓶扩增不但耗材消耗量大，而且时间的付出也多。生物反应器通常用于大规模扩增细胞，能够一次性获得大量细胞，既节省了大量的耗材，又节省了很多时间。但是，本领域目前还没有成功大规模扩增获得骨髓间充质干细胞的先例。

因此，本领域迫切需要研究骨髓间充质干细胞的大规模扩增方法，以满足科学研究以及临床应用所需。

发明内容

本发明的目的在于提供一种规模化扩增骨髓间充质干细胞的方法。

在本发明的第一方面，提供一种培养骨髓间充质干细胞的方法，所述方法包括：

(1)将骨髓间充质干细胞进行低血清驯化，获得低血清驯化的骨髓间充质干细胞；

(2)将步骤(1)获得的低血清驯化的骨髓间充质干细胞以2.3-2.7×10⁵细胞/ml(较佳地2.4-2.6×10⁵细胞/ml；更佳地2.5×10⁵细胞/ml)的细胞密度培养于血清浓度0.8-4％(v/v)(较佳地1-3％(v/v))的培养基中，所述培养基中还加入密度为3.5-4.5mg/ml(更佳地为3.8-4.2mg/ml；更佳地为4mg/ml)的微载体cytodex3；培养4-10天；

(3)分离获得骨髓间充质干细胞。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的低血清驯化的方法为：将骨髓间充质干细胞依次加入到血清含量依次递减的培养基中，使得骨髓间充质干细胞适应低血清环境。

在另一优选例中，所述的低血清驯化方法为：

(a)将细胞以1×10⁵细胞/ml密度接种至10％(v/v)血清的培养基中，培养48h，收获接近90％汇合的细胞；

(b)细胞再以2×10⁵细胞/ml密度接种至7％(v/v)血清的培养基中，当细胞生长至接近90％汇合时，胰酶消化收获细胞，并以相同的密度接种至7％血清的培养基中培养；

(c)等(b)的细胞再次生长至接近汇合时，将收获的细胞重复(b)的流程依次接种至5％(v/v)、3％(v/v)、1％(v/v)血清的培养基中进行培养。

在另一优选例中，步骤(2)中，在起始培养的20-28小时(如24小时)内，培养基中血清含量3±0.5％(v/v)；之后培养基中血清含量1±0.2％(v/v)(更佳地1±0.1％(v/v))。

在另一优选例中，每隔0.5-2天(如1天)换培养基50％。

在另一优选例中，步骤(2)中，在起始培养的前10-14小时(如11-13小时)，以半体积培养基培养，也即在该阶段，培养基中细胞和微载体cytodex3处于倍增的密度，如细胞为4.6-5.4×10⁵细胞/ml；或微载体cytodex3为7-9mg/ml；在起始培养10-14小时之后，以全体积培养基培养，也即在该阶段，细胞为2.3-2.7×10⁵细胞/ml；或微载体cytodex3为3.5-4.5mg/ml。

在另一优选例中，步骤(2)中，前12小时进行间歇搅拌，3min/h；13-48小时以35rpm转速培养；49-96小时以45rpm转速培养；97小时及之后以50rpm转速培养；或

步骤(2)中，控制溶氧(DO)为40±10％(v/v)；或

步骤(2)中，控制pH值分别为与7.2±0.2。

在另一优选例中，所述的培养基是DMEM/F12培养基。

在另一优选例中，骨髓间充质干细胞在10mL-100L(如100mL，1.5L，5L，10L，50L)的系统中培养。