[发明专利]一种规模化扩增骨髓间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将骨髓间充质干细胞进行低血清驯化，获得低血清驯化的骨髓间充质干细胞；

(2)将步骤(1)获得的低血清驯化的骨髓间充质干细胞以2.3-2.7×10⁵细胞/ml的细胞密度培养于血清浓度0.8-4％(v/v)的培养基中，所述培养基中还加入密度为3.5-4.5mg/ml的微载体cytodex3；培养4-10天；

(3)分离获得骨髓间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的低血清驯化的方法为：将骨髓间充质干细胞依次加入到血清含量依次递减的培养基中，使得骨髓间充质干细胞适应低血清环境。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的低血清驯化方法为：

(a)将细胞以1×10⁵细胞/ml密度接种至10％(v/v)血清的培养基中，培养48h，收获接近90％汇合的细胞；

(b)细胞再以2×10⁵细胞/ml密度接种至7％(v/v)血清的培养基中，当细胞生长至接近90％汇合时，胰酶消化收获细胞，并以相同的密度接种至7％血清的培养基中培养；

(c)等(b)的细胞再次生长至接近汇合时，将收获的细胞重复(b)的流程依次接种至5％(v/v)、3％(v/v)、1％(v/v)血清的培养基中进行培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在起始培养的20-28小时内，培养基中血清含量3±0.5％(v/v)；之后培养基中血清含量1±0.2％(v/v)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每隔0.5-2天换培养基50％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，前12小时进行间歇搅拌，3min/h；13-48小时以35rpm转速培养；49-96小时以45rpm转速培养；97小时及之后以50rpm转速培养；或

步骤(2)中，控制溶氧为40±10％(v/v)；或

步骤(2)中，控制pH值分别为与7.2±0.2。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基是DMEM/F12培养基。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，分离获得骨髓间充质干细胞的方法为：从培养基中分离贴附了细胞的微载体cytodex3，洗涤，以胰蛋白酶消化，间歇震荡以使细胞从微载体cytodex3脱落，分离去除微载体cytodex3。

9.一种制备成软骨细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)根据权利要求1-8任一所述的方法获得骨髓间充质干细胞；

(ii)将(i)的骨髓间充质干细胞进行成软骨细胞诱导分化，从而获得成软骨细胞。

10.一种制备成骨细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)根据权利要求1-8任一所述的方法获得骨髓间充质干细胞；

(ii)将(i)的骨髓间充质干细胞进行成骨细胞诱导分化，从而获得成骨细胞。