[发明专利]一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法

说明书

技术领域

本发明属于生物安全领域，具体涉及一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白致敏性的安全评价方法。

背景技术

转基因植物从诞生以来，其食用安全性一直是科学界、政府和广大消费者关心的焦点问题。至今，除了转巴西坚果基因大豆有致敏性，转GNA基因马铃薯的安全性有争议外，其他许多的转基因食品已被现在的研究结果证明是安全的，但转基因食品的长期效应应有待探讨，能够批准一种新的转基因食品的指标体系还有待进一步完善。目前，转基因食品安全性评价的程序基本上包括五个方面：1)新基因产品的特性的研究；2)分析营养物质和已知的毒素含量的变化；3)潜在致敏性的研究；4)转基因食品与动物或人类肠道中的微生物群进行基因交换的可能及其影响；5)活体和离体的毒理和营养评价。

转基因食品与传统食品最主要的差异在于前者含有用基因工程技术导入的外源基因及其表达产物-蛋白质，由于外源基因因编码蛋白是传统食品所不含有的新成分，因而成为人体过敏原的危险性很大。因此，转基因食品致敏性评价是安全性评价中的一项十分重要的内容。目前，国际上大多采用世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)所制定的评价体系评价转基因食品的致敏性。该评价体系中一项重要的评价原则是个案评价原则，指对不同的转基因生物(材料)应进行逐个评估的原则，即不能将某一类特定转基因生物或产品进行生物安全评价的结果和结论，任意和无原则地拓展到其他类型的转基因生物及其产品上，所以，对转基因食品的致敏性评价必须以个案评价原则为基础。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，是目前研究最为深刻、应用最为广泛的微生物杀虫剂。它能产生对多种昆虫或无脊椎动物有害的毒素，其中，最常见的Bt毒素是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，于芽胞形成期在菌体的一端或两端形成，Bt的杀虫大多或完全依赖于ICPs(依昆虫而定)，其中，cry1c蛋白就是ICPs的一种，产生的cry1c蛋白能用于杀虫实验及转基因植物的抗虫防护。例如，将Cry1C基因转入到水稻中来控制鳞翅类害虫，但对这种转基因大米是否对人体无害还不清楚。癌症研究院通过对小鼠进行高剂量的填喂法喂养，每千克的老鼠填喂5g的Cry1C蛋白，研究显示Cry1C蛋白不会对老鼠引起不良反应，且在体外的模拟的肠胃液中快速降解。ICR小鼠填喂Cry1C蛋白后进行急性经口毒性试验，经变性梯度凝胶电泳分析显示：Cry1C蛋白对小鼠是无害的。但是，目前为止，没有报道对Cry1C蛋白的致敏原性进行研究。Cry1C蛋白的蛋白序列具有高度的特异性，因此，Cry1C基因在广泛应用于水稻之前，有必要对Cry1C蛋白进行安全性评价，特别是建立起动物模型来评价Cry1C蛋白的致敏原性成为研究者的重要任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法，将转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白序列与已知的过敏原或毒素序列进行序列同源性分析，检测分析了Cry1C蛋白对胃蛋白酶的消化稳定性，并建立了动物致敏原性模型。

本发明中由于在转基因水稻T1C-1中Cry1C蛋白含量低，所以，本发明将转基因水稻T1C-1中的Cry1C基因连接到pET30a-质粒上，然后转化到大肠杆菌中进行表达，再经纯化和重折叠，最终从大肠杆菌中获得足够的Cry1C蛋白用于体外和动物研究中，从而评价Cry1C蛋白在人类食物和动物饲料中的致敏性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所述转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法，具体包括如下步骤：

1、将转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白序列与已知的过敏原和毒素蛋白序列进行序列同源性比对分析，其中，Cry1C蛋白序列如SEQ ID NO 1所示。

2、转基因水稻T1C-1表达的Cry1C基因在大肠杆菌中表达