[发明专利]一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法

权利要求书

1.一种转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白的致敏性评价方法，包括如下步骤：

1)转基因水稻T1C-1表达的Cry1C蛋白序列与已知的过敏原和毒素蛋白序列进行序列同源性比对分析，其中，Cry1C蛋白序列如SEQ ID NO1所示；

2)转基因水稻T1C-1表达的Cry1C基因在大肠杆菌中表达：将转基因水稻T1C-1中的Cry1C基因连接到pET30a-质粒上，得到含Cry1C基因的质粒pET30a-Cry1C，并将pET30a-Cry1C转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后，35-40℃下，在LB液体培养基中进行Cry1C融合蛋白表达，当细胞在600nm时的光密度值达到0.6-1.0时，加入0.3-0.9mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，再在35-40℃条件下培育2-8个小时，之后超声破碎细菌，通过镍柱得到首次纯化的Cry1C蛋白，再在35-40℃条件下经肠激酶15-20h消化作用去除六组氨酸标签，即得原核表达Cry1C蛋白；

3)原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻中Cry1C蛋白的结构和功能一致性验证：将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻表达Cry1C蛋白进行蛋白印迹检测，由检测结果验证两者的结构一致性；将将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白和转基因水稻表达Cry1C蛋白分别进行杀虫实验，根据杀虫实验结果验证两者的功能一致性；

4)Cry1C蛋白在体外的消化性验：将步骤2)得到的原核表达Cry1C蛋白分别加入到模拟的胃液和模拟的肠液中，其中，原核表达Cry1C蛋白在模拟的胃液和模拟的肠液中的浓度分别为0.20～0.30mg/ml和0.08～0.18mg/ml，将上述样品在37±2℃下培育，然后在不同的时间分别取出样品，并分别与2X SDS-PAGE蛋白变性样品缓冲液混合，进行SDS-PAGE分析，再通过转膜进行Western blot鉴定；

5)Cry1C蛋白在动物模型中的免疫原性评价：选用四组6-8周的雌性BALB/c小鼠，分别注射0.1-0.23mL的硫酸铝钾的磷酸缓冲液、0.1-0.3mL的10μg/mL卵清蛋白的磷酸缓冲液、0.1-0.23mL的0.25％的原核表达Cry1C蛋白的磷酸缓冲液、0.1-0.23mL的0.1％的原核表达Cry1C蛋白的磷酸缓冲液。15-30天后取四组小鼠的血液，实验分析前血清在-20℃冰箱保存备用，检测特异性蛋白IgG和IgE抗体。

2.根据权利要求1所述的致敏性评价方法，其特征在于，步骤4)中所述原核表达Cry1C蛋白与模拟的胃液中胃蛋白酶的质量比率为1∶15-23，所述原核表达Cry1C蛋白与模拟的肠液中胰蛋白酶的质量比率为1∶15-23。

3.根据权利要求1所述的致敏性评价方法，其特征在于，步骤5)中采用酶联免疫吸附反应方法、颗粒凝集法、2型抗体诊断试剂或2金标快速诊断试剂检测法检测特异性蛋白IgG和IgE抗体。