[发明专利]一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法。

背景技术

志贺氏菌(Shigella spp.)俗称痢疾杆菌，作为一种具有高度传染性革兰氏阴性肠道致病菌，主要通过侵入人结肠上皮细胞最终定位于大肠，而引起典型细菌性痢疾(发热、腹痛、里急后重、大便脓血)，而毒力大质粒则是其致病性的最主要的因素，包含有大概32个与毒力有关的基因，主要包括与III型分泌系统有关的mxi-spa基因，与细菌侵入上皮细胞密切相关的ipaBCD，以及ipgC等毒力基因。

志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，2010年我国卫生部公布的全年法定报告传染病疫情中，细菌性痢疾发病数位居第四，其中福氏2a型占到细菌性痢疾总数的50-70％，次于病毒性肝炎，肺结核和梅毒。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素，但不同菌群及血清型之间虽然无交叉免疫，但存在交叉抗药性，加上临床分离多重耐药菌株的不断增加，常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战；由于急性期治疗不及时、对耐药菌株用药不当、治疗不彻底等原因可导致急性菌痢转变成慢性菌痢，故对细菌性痢疾的治疗方式受到越来越严峻的挑战。因此，开发针对细菌的多糖疫苗重新引起了人们的研究兴趣。

在疫苗生产中，通常是使用的减毒(或无毒)病原菌(病毒)，所以需获得无毒菌株，而志贺氏菌的毒力大质粒是其致病性的主要因素。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌A。

本发明提供的重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。

上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒力大质粒为pCP301。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组菌A的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因，得到重组菌A。

上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因为依次去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因。

上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1(通过抗生素抗性筛选)；

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因的方法包括如下步骤：

3)将抗性筛选标记物基因替换掉所述重组菌B基因组中的O-抗原连接酶基因，得到去除O-抗原连接酶基因的中间重组菌2；

4)去除所述中间重组菌2中的所述抗性筛选标记物基因，得到所述重组菌A。

上述方法中，步骤2)包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，以去除其中的毒力大质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；所述培养为至少培养3代，所述毒力大质粒为pCP301；

步骤3)包括如下步骤：先将含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒导入所述重组菌B，得到中间重组菌3，再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中，得到中间重组菌4(通过抗生素抗性筛选)；再将所述中间重组菌4在40℃-42℃培养，得到中间重组菌2，所述培养为传代至少2次，每次至少13小时；

步骤4)包括如下步骤：先将编码FLP重组酶的质粒导入中间重组菌2中，得到中间重组菌5，再将所述中间重组菌5在40℃-42℃培养，得到所述重组菌A，其中，所述培养为连续培养2代，培养时间为至少12小时。

上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒力大质粒为pCP301。

上述方法中，步骤1)中，所述与毒力大质粒不相容的质粒为pKDinc；

步骤3)中，所述抗性筛选标记物基因为卡那霉素基因；

所述含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒为质粒pKOBEG；

所述含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

步骤4)中，所述编码FLP重组酶的质粒为质粒pCP20。

上述方法中，步骤3)中，在所述再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中的步骤前还包括将所述中间重组菌3经L-阿拉伯糖诱导培养的步骤。