[发明专利]一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法

权利要求书

1.一种重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。

2.一种制备权利要求1所述的重组菌A的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因，得到重组菌A。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因为依次去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1；

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因的方法包括如下步骤：

3)将抗性筛选标记物基因替换掉所述重组菌B基因组中的O-抗原连接酶基因，得到去除O-抗原连接酶基因的中间重组菌2；

4)去除所述中间重组菌2中的所述抗性筛选标记物基因，得到所述重组菌A。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

步骤2)包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，以去除其中的毒力大质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

步骤3)包括如下步骤：先将含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒导入所述重组菌B，得到中间重组菌3，再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中，得到中间重组菌4；再将所述中间重组菌4在40℃-42℃培养，得到中间重组菌2；

步骤4)包括如下步骤：先将编码FLP重组酶的质粒导入中间重组菌2中，得到中间重组菌5，再将所述中间重组菌5在40℃-42℃培养，得到所述重组菌A。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述与毒力大质粒不相容的质粒为pKDinc；

步骤3)中，所述抗性筛选标记物基因为卡那霉素基因；

所述含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒为质粒pKOBEG；

所述含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

步骤4)中，所述编码FLP重组酶的质粒为质粒pCP20。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

步骤3)中，在所述再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中的步骤前还包括将所述中间重组菌3经L-阿拉伯糖诱导培养的步骤。

8.一种制备重组菌B的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒，得到重组菌B。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1，

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

步骤2)具体包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述与毒力大质粒不相容的质粒具体为pKDinc。

10.由权利要求8或9所述的方法制备得到的重组菌B；

或一种DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的DNA分子。