[发明专利]微量游离mRNA提取和富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种医学提取方法，特别涉及微量游离mRNA提取和富集方法。

背景技术

近年研究发现，肿瘤患者血浆中的游离mRNA(cell-free mRNA)蕴含丰富的肿瘤信息，如CK19mRNA若在血清/血浆中检出，可提示血中存在肿瘤细胞或已经发生了临床影像学难以发现的微转移；结肠癌患者肿瘤组织与血浆hTERT-AT mRNA表达水平呈显著相关，且均能够反映病情进展的程度，提示游离mRNA能够客观反映肿瘤信息；乳腺癌患者血浆游离CyclinD1和TS mRNA表达水平与乳腺癌患者预后及药物治疗疗效相关。血浆游离核酸的发现与检测为肿瘤的早期诊断、实时监控及实时个体化药物治疗提供了新的检测来源。

但是，由于血浆中大量RNA酶的存在，血浆游离mRNA非常容易发生降解，且由于血液的稀释作用，因此，每毫升血浆游离mRNA的量非常少(＜1ug)。

在本发明之前，基于以上两个主要原因，血浆游离mRNA的检测存在检出率很低，标本量需求大，重复性差等问题。因而，急需建立具备实际应用价值的敏感性高、特异性高、重复性好的微量游离mRNA抽提、富集与定量检测技术，来达到对血液或其他液体中所含的微量游离mRNA的检测，以满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的就在于解决上述问题，研制一种微量游离mRNA提取和富集方法。

本发明的技术方案是：

微量游离mRNA提取和富集方法，其主要技术步骤在于：

(1)抽取含微量游离mRNA的液体，两次离心，获取上清；

(2)取上清加入到Trizol LS溶液中，室温震荡；

(3)向其中加入氯仿，剧烈震荡；

(4)离心，吸取水相层至新管；

(5)加入70％乙醇，混匀；将含有乙醇和RNA的液体转移到带有滤网的收集管中，离心；

(6)洗涤滤网和滤网上的RNA；

(7)离心，干燥滤网和RNA；

(8)加无RNA酶水溶解RNA，离心；

(9)加入DNA酶；

(10)终止DNA酶反应，离心，获得最终富集并纯化的RNA，以其为模板，反转录为cDNA，-20℃保存。

本发明的优点和效果在于发明了一种从少量液体(750ul)中抽提和富集微量(＜1ug)游离mRNA的方法，实时定量荧光PCR扩增证实相关目的基因的表达，并且显著提高了微量游离mRNA的检出率。本发明可从少量(750ul)血浆标本中扩增肿瘤相关基因，可从少量(750ul)血浆标本中扩增化疗相关基因，操作方便，灵敏度高，特异性强，可重复性强。具体而言：

1.突破了传统上从肿瘤组织或者肿瘤细胞中提取RNA的方法，开创性地成功从少量液体中抽提、富集并定量检测了微量游离mRNA；

2.可从少量(750ul)血浆标本中扩增肿瘤特异性表达基因；

3.可从少量(750ul)血浆标本中扩增相关肿瘤标记物，如CEA，CA199，CA125等；

4.可从少量(750ul)血浆标本中扩增化疗相关基因(如BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1、APTX等)；

5.与目前已报道的游离mRNA检测方法相比(目前文献所报道的mRNA提取方法大多基于RNA沉淀技术或者是磁珠富集技术)，本方法检出率高，灵敏度高，重复性强，特异性强，成本低，操作简便，省时省力；

6.与从肿瘤组织相关基因的mRNA定量检测方法相比，本方法具有“实时”的巨大优点，且该方法灵敏度高，操作简便，省时省力；

7.与循环肿瘤细胞中相关基因的mRNA定量检测方法相比，本方法无需繁琐而复杂的循环肿瘤细胞的分离、富集、裂解等步骤，且检出率高，灵敏度高，重复性强，操作简便，省时省力。

附图说明

图1——部分血浆标本游离BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1和APTXmRNA的扩增示意图。

图2——BRCA1、ERCC1、hENT1、RRM1、TS、Topo1和APTX mRNA在血浆的表达水平及检出率对比示意图。

具体实施方式

本发明的技术步骤如下：

(1)所有物品均经去RNA酶处理；

(2)将2ml血液加入0.5ml 3.8％枸橼酸钠溶液的无RNA酶管中；

(3)3000g，4℃离心10分钟，将上清转移至新管；