[发明专利]胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法。 

背景技术

根据本实验室筛选出的以及经文献报导的响应逆境胁迫的microRNA，我们选取12个microRNA基因：miR156j、miR168a、miR168b、miR169o、miR171a、miR393a、miR408、miR1444a、miR1446a、miR1447、miR1448、miR1450进行胡杨microRNA前体的克隆。 

其中miR168a、miR168b、miR171a、miR393a、miR408为物种间保守的miRNAs(Barakat et al，2007)，文献报道miR168a及miR168b的靶基因AGO1参与siRNA和成熟miRNA的形成通路，即成熟miR168通过靶基因AGO1调控所有下游miRNAs的合成，对其自身合成也形成了一个反馈调节(Vaucheret et al，2006)，研究miR168在胡杨逆境胁迫中的表达及功能可有效探索miR168对逆境响应miRNAs表达量的调节，进而影响靶基因及逆境信号传导途径。生物信息学预测miR171a的靶基因为GRAS转录因子，拟南芥GRAS家族基因可能响应渗透胁迫和干旱胁迫(Liu et al，2006)。毛果杨miR408的靶基因为早期干旱响应蛋白(Lu et al，2005)。拟南芥miR393a在旱胁迫下表达明显上调(Sunkar et al，2004)，其靶基因F-box protein是一类含有50个氨基酸左右具有蛋白质间相互作用的功能的基序的蛋白质，这一类蛋白质具有许多种生物学功能；bHLH transcription factor转录因子家族有报道与植物的抗逆性密切相关(Dharmasiri et al，2005；Danielle et al，2002)。miR7015、miR156j、miR169o、miR1444a、miR1446a、miR1447、miR1448、miR1450为毛果杨中特有而拟南芥中未发现的miRNAs，可能与植物发育，代谢及生物、 非生物抗性相关。毛果杨miR1444a的靶基因多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO)是一类普遍存在于动物、植物、细菌和真菌中的金属蛋白酶。其功能包括甲酚酶(Cresolase，将单酚氧化为二酚)、二酚氧化酶/儿茶酚氧化酶(catecholase，将二酚氧化为醌)。PPO基因进行组织特异性表达，参与植物生物抗性与非生物抗性(Lu et al，2008)。miR1b、miR3a、miR4、miR7a、miR12为Li等(2009)通过构建小RNA cDNA文库的方法在脱水逆境处理的胡杨中发现的新的特异性非保守miRNAs，可能与干旱等非生物逆境信号相关，需要进一步的表达与抗逆功能分析。 

基于以上理由，我们有针对性地对这些与抗逆性可能相关的miRNA在胡杨中进行前体克隆以及成熟体测序，以便进行下一步逆境表达分析及功能验证研究，通过实验验证确定它们的抗逆功能，为揭示胡杨miRNAs逆境信号调控机制打下基础。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，有效推进科学发展。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法，包括： 

采用PCR技术从胡杨DNA中克隆得到胡杨microRNAs前体序列，并对其进行茎环二级结构分析和命名； 

首次在胡杨中同时对miRNA成熟体与前体在脱水与高盐逆境处理下进行表达检测，得出microRNA前体与成熟体之间可能的关系模式，同时发现了一些与脱水，高盐逆境胁迫相关的microRNAs基因。 

优选的，所述胡杨microRNA前体的克隆包括： 

杨基因组DNA提取； 

PCR扩增； 

目的片段的回收与纯化； 

目的片段连入载体及转化； 

大肠杆菌单克隆送测。 

优选的，所述的胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法还包括：不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析。 

优选的，所述不同胁迫处理下胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量分析，具体包括： 

CTAB-PVP法提取胡杨总RNA； 

胡杨microRNA前体及成熟体的实时定量RT-PCR引物设计；