[发明专利]含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及慢病毒表达载体，尤其是一种含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

c-erbB2/HER2/neu编码产物p185^erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。c-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和p185^erbB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。p185^erbB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。p185^erbB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局(FDA)已于1998年10月正式批准将一株抗p185^erbB2人源化抗体Trastuzumab(商品名Herceptin)用于临床治疗p185^erbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗p185^erbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。

目前构建载体表达抗体分子的主要方式有三类：一是将轻、重链基因分别连接至不同表达载体；二是轻、重链基因在同一载体上但处于不同的表达单元；三是以内部核糖体进入位点(IRES)连接轻、重链，使轻重链处于同一表达单元。但是，这些方式存在一些缺陷，如被表达的基因起始效率低，启动子之间相互干扰，上游基因与下游基因的表达不平衡等，造成轻、重链表达水平存在显著差异，导致完整抗体分子表达水平较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗p185^erbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。

含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分别是抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ.ID.No.2)和抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ.ID.No.1)，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ.ID.No.15)。

抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人p185^erbB2单抗重链可变区基因vH(SEQ.ID.No.13)和人IgG1的重链恒定区基因γ1(SEQ.ID.No.14)连接而成；抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人p185^erbB2单抗轻链可变区基因vL(SEQ.ID.No.16)和人IgG1的轻链恒定区基因κ(SEQ.ID.No.17)连接而成。

上述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法：用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框ORF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。

上述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法包括以下步骤：

<1>抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增

用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gamma1-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L；扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因；

<2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建

①接头片段F2A的合成  该片段由3部分构成：含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列；