[发明专利]含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分别是抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。

2.根据权利要求1所述的含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于：所述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人p185^erbB2单抗重链可变区基因vH和人IgG1的重链恒定区基因γ1连接而成；所述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人p185^erbB2单抗轻链可变区基因vL和人IgG1的轻链恒定区基因κ连接而成。

3.根据权利要求1所述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框ORF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。

4.根据权利要求3所述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增

用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gamma1-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L；扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min；PGR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因；

<2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建

①接头片段F2A的合成  该片段由3部分构成：含Nsi I酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu II酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列；

②中间质粒pUC57/F2A的构建  将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamH I和Xba I之间，获得中间质粒pUC57/F2A；

③含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L的构建  用BamH I和Xba I双酶切质粒pUC57/F2A，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段pUC57；进而用Pvu II酶切接头片段F2A，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Pvu II酶切位点的接头片段F2A；用Pvu II和Xba I双酶切嵌合轻链L，获得5’端为Pvu II酶切位点和3’端为Xba I位点的轻链片段L；然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体pUC57，获得含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L；

④片段H-F2A-L的拼接  用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A-L，获得片段F2A-L；进而用Nsi I酶切片段F2A-L，获得5’端为Nsi I酶切位点和3’端为Xba I酶切位点的片段F2A-L；用BamH I和Nsi I双酶切嵌合重链H，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Nsi I位点的重链片段H；通过T4DNA连接酶与片段F2A-L相连，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Xba I位点的嵌合抗体全长片段H-F2A-L；

<3>慢病毒表达质粒pwpI/H-F2A-L的构建

将纯化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端补平试剂盒补平两端；同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-F2A-L连接，连接产物转化DH-5α感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EF1α和重链下游引物gamma1-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆pWPI/H-F2A-L，并进行测序验证，即得；

所述各引物为

H-A：5’-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，

gamma1-B：5’-ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3’；

L-A：5’-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，

Kappa-B：5’-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’；

EF1α：5’-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3’。