[发明专利]一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，具体而言，涉及一种利用表面增强拉曼信号检测人乳腺癌MCF-7细胞的细胞探针复合物及其制备方法。

背景技术

癌症是导致人类死亡的一种重要原因，据世界卫生组织统计，每年约有700万人死于各类癌症疾病。在女性当中，乳腺癌是一种发病率最高的癌症疾病，且近年来乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，2008年全球乳腺癌的发病率高达41.4%。乳腺癌的早期诊断和治疗对于降低乳腺癌死亡率，提高疾病患者5年存活率具有极其重要的意义。

癌症是一种控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，其发生与发展与细胞的状态密切相关。在各类癌症疾病中，癌细胞的生长与分裂速度远远超过正常细胞，还会局部侵入周遭正常组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。因此，发展一种可靠的、灵敏的检测人乳腺癌细胞的方法对于实现乳腺癌的早期诊断、筛查、治疗及预后意义重大。

在当前的乳腺癌医学诊断方法中，影像技术是一种最为常见的有效方法。但是影像技术也有其明显的不足，如难以分辨一些病理性特征相同或相近的癌细胞，难以灵敏的检测到癌症早期癌细胞水平较低时的癌变细胞等。而提高检测的特异性及灵敏度对于癌症的早期诊断治疗作用重大，因此越来越多的工作倾向于从单细胞、单分子水平上对癌细胞进行检测。

目前对单细胞研究的技术主要包括荧光光谱技术、扫描探针显微技术、微流控技术、毛细管电泳技术等, 但大多数技术存在侵入性, 会对细胞产生破坏。光学技术具有无侵入、无电离辐射、允许多种模式成像、可获得实时与定量等多种信息的特点, 在生命科学研究中占有越来越重要的地位。目前已经在生物医学领域中得到应用的光谱技术主要有紫外可见吸收光谱、红外光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。拉曼光谱与其它光谱相比具有一些突出的优点，如稳定性高、不易猝灭、可用红光激发、对生物样品损坏小、不受生物样品自身荧光及水的干扰等, 因而尤其适合于细胞样品的研究。

提高拉曼光谱方法的靶向性对于提高检测的特异性和灵敏度十分重要。癌细胞的细胞膜表面通常具有一些与正常细胞不具有的蛋白或者糖基，常用的标志物包括表皮生长因子受体、磷酸酶及叶酸受体等。适体（aptamer）是用配体指数富集法系统演化（SELEX）技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列，可以与蛋白质甚至整个细胞发生特异性结合作用。将这些癌细胞标志物的核酸适体进行表面增强拉曼的功能化并与癌细胞相互作用，可实现基于表面增强拉曼光谱的高灵敏度、高特异性的癌细胞靶向检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物及其制备方法，通过开发一种功能化的乳腺癌细胞适体-纳米复合材料（Au-Ag-aptamer），并基于所述纳米复合材料制成细胞探针复合物（Rh 6G-Au-Ag-aptamer），由于纳米复合材料具有强的表面拉曼增强作用，适体和细胞表面标志物间的强的专一性作用，细胞探针复合物对人乳腺癌细胞MCF-7有高度的选择性，可用于基于表面增强拉曼信号的乳腺癌细胞MCF-7的高灵敏度、高特异性检测。

完成上述发明任务的技术方案是：

一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物（Rh 6G-Au-Ag-aptamer），其特征在于，所述的探针复合物以核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）为模板，其碱基上沉积金/银双金属合金纳米粒子，纳米粒子表面固载拉曼信号分子罗丹明6G。

所述的细胞探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer其粒径约为20 ～120nm。

所述的细胞探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer按以下方法合成：

将核酸适体S2.2溶解在磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）中，加入一定体积比的NaAuCl₄和AgNO₃溶液（体积比1~5：1），混合并搅拌均匀，在暗处放置12小时以上，置于紫外灯下光照5 min至60 min，形成Au-Ag-aptamer纳米复合物；将罗丹明6G（Rh 6G）溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，避光搅拌后离心处理，用PBS洗涤除去未吸附的Rh 6G分子，得到所述的探针复合物（标记为Rh 6G-Au-Ag-aptamer）。

所述的Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米探针复合材料的制备方法具体包括以下步骤：