[发明专利]用于甲型肝炎病毒核酸捕捉、检测和定量的寡核苷酸的鉴定

说明书

本申请是国际申请PCT/US03/18827，国际申请日2003年6月12日，中国国家阶段申请号03819416.3，名称“用于甲型肝炎病毒核酸捕捉、检测和定量的寡核苷酸的鉴定”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及病毒诊断领域。更具体地说，本发明涉及准确诊断甲型肝炎病毒感染和检测生物样品中甲型肝炎病毒的核酸分析方法。

发明背景

甲型肝炎是一种肠道传染病，可引起发热、不适、食欲缺乏、恶心、腹部不适及黄疸。引起甲肝的原因是甲肝病毒感染，这是一种小的无包膜的球形病毒，属于小核糖核酸病毒科肝炎病毒属。HAV基因组由一条单链线性RNA分子组成，长度为7.5kb，其编码的多聚蛋白前体经处理后形成结构蛋白并具有病毒复制所需要的酶活性(Najarian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2627-2632(1985))。HAV在细胞培养物中生长状况差，产生的病毒数很少，不能引起细胞病变。虽然从病毒颗粒中提取的HAV RNA可以感染细胞培养物(Locarnini等，J.Virol.37：216-225(1981)和Siegl等，J.Gen.Virol.57：331-341(1981))，但是直接对病毒基因组进行操作比较困难，因为病毒基因组是由RNA构成的。

HAV编码4种衣壳蛋白(A、B、C和D)，这些蛋白含有能被感染个体的抗体识别的主抗原性结构域。除了衣壳蛋白以外，也有报道证明在结构蛋白如2A和病毒编码蛋白酶中也存在抗原性结构域。其他重要的HAV抗原性结构域位于衣壳蛋白前体P1和2A之间的连接处。

HAV通常是由粪-口途径传播的，通过人与人的接触或摄入被污染的食物或水而感染。但是，输入血浆产物也可能是HAV的传播途径。由于缺乏脂质包膜，因此HAV很难通过物理化学方法灭活，而且能够耐受常规的血制品加热消毒。和细小病毒B19一样，HAV也可以通过输入血浆衍生物进行传播。开发敏感的高特异诊断方法来鉴定感染个体内HAV抗原和/或抗体的以及开发核酸检测方法来检测病毒血样以避免其传播是公共卫生领域一大课题。

Robertson等人的美国专利No.5,290,677描述了利用抗体捕捉完整HAV病毒的方法。分离RNA，制备其cDNA。然后用根据HAV基因组上VP1和VP3衣壳区的引物PCR扩增该cDNA，扩增出的产物用根据基因组同一区的探针进行检测。引物和探针的选择根据所要检测的HAV的基因型来确定。

目前，仍然需要开发出一种可靠的诊断试验方法来检测病毒血样中的甲肝病毒，以避免病毒通过血液或血浆衍生物传播，或者通过人与人之间的近距离接触传播。

发明概述

本发明的目的在于开发出一种灵敏可靠的核酸诊断方法用于检测潜在感染个体来源的生物样品中的HAV。本文所描述的方法用样品中提取的核酸作为模板通过PCR、转录介导的扩增(TMA)以及5’核酸酶法如TaqMan^TM技术来扩增HAV序列上的保守基因组区。这些方法可检测病毒血样中的HAV。在某些实施方式中，本发明利用据HAV基因组5’UTR区设计的引物和探针。另外，本发明的方法还可实现一锅化分析(one-pot analysis)，即捕获的样品核酸可在一个容器内扩增和检测。利用本发明的方法可鉴定被感染的样品，避免被感染的样品被输入以及避免这些感染的样品被制成血液衍生物。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种检测样品中HAV感染的方法，该方法包括：

(a)在高离液盐浓度下或适于固相支持物与靶核酸序列形成复合物的杂交条件下使生物样品与固相支持物接触；

(b)从样品中分离(a)步骤后的固相支持物；

(c)扩增可能存在的靶核酸序列；以及

(d)检测扩增的靶核酸序列，其存在表明样品中存在HAV。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中HAV感染的方法，该方法包括：

(a)在高离液盐浓度下或适于固相支持物与靶核酸序列形成复合物的杂交条件下使生物样品与固相支持物接触；

(b)从样品中分离(a)步骤后中的固相支持物；以及

(c)利用据HAV基因组5’UTR设计的引物例如具有SEQ ID NOs：1和2所示的序列的引物，扩增靶核酸链。在某些实施方式中，该方法还包括利用根据HAV基因组5’UTR的探针例如SEQ ID NOs：3所示探针检测被扩增的靶核苷酸以判断样品中是否存在HAV的步骤。