[发明专利]一种低拷贝基因的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因分离方法，尤其是指一种低拷贝基因的分离方法。

背景技术

目前，基因的提取与分离方法往往是将生物样品如血液、组织中的总基因组或信使RNA(mRNA)提纯出来以达到分离的目的，并且很多国内外生物公司也成功开发了商业化试剂盒，被广大科研工作者使用。在这些提取和分离的总基因组或信使RNA中，由于基因的富集程度各异，其中低拷贝基因往往只有高拷贝基因的万分之一，甚至一百万分之一，在诸如PCR、探针杂交等基因检测过程中会被遗漏或埋没，因而不能真实反映低拷贝基因存在与否，造成样本的误读，严重影响了后基因组时代的基因分析结果，而这些被遗漏的基因往往是具有生物学和病理学上的重要意义。目前对这些低拷贝基因尚无有效的分离方法，特别当这些基因存在于高复性、高拷贝基因样本中时情况尤为严重。

基因检测方法是目前最为成熟与敏感的方法。与传统的检测方法相比，基因检测方法还有其本身显著的优越性，即此法以基因的特殊相辅结构异常或基因表达异常为切入点，而不是从基因的表型开始，因此往往在疾病出现之前就可做出诊断，并且灵敏度高，特异性强，为疾病的预防、早期诊断、及时治疗以及对突发疫情的监控和应急处理带来了巨大的帮助。

无论何种基因检测方法都依赖于基因模板作为起始物。一般而言，绝大多数的mRNA都以单链的形式存在。以探针杂交方法而言，由于核酸探针对超低拷贝基因乃至单拷贝基因往往失去其敏感性，因而其不能被有效检测出和定量，成为盲点。PCR方法是将mRNA反转录成cDNA模板，然后籍引物进行扩增。超低拷贝或单拷贝基因在与高拷贝基因并存时，不但在反转录过程中被竞争性淘汰，而且在PCR扩增中也被竞争性抑制，因而造成检测失败。以上两种最为常用的基因检测方法都存在超低拷贝或单拷贝基因检测中的盲点，造成运用上的局限性。

为了提高基因检测方法对超低拷贝或单拷贝基因的获检率，对高复性样本中超低拷贝或单拷贝基因的富集与分离至关重要。目前尚无有效的方法和试剂盒能解决这一问题。本发明利用核糖核酸酶T1(Ribonuclease T1，RNase T1)具有对双链RNA选择性保护而对单链RNA有效消化的功能，对待检基因先用结构相辅的反义链RNA特异性分子进行退火，与有义链待检RNA形成双链，而免受消化。随着其它高丰度单链RNA相续消化，使靶基因得以富集与分离，有效地提高了基因检测对低丰度基因的阳性检测率，排除假阴性。

RNase T1是一种内切核糖核酸酶，在G残基位点特异性降解单链RNA。该酶通过形成核苷2’，3’-环磷酸中间体来切割3’-鸟苷残基与邻近核苷酸5’-OH基团之间的磷酸二酯键(Takahashi，K，The Enzymes，V，(Boyer，P.D，Ed.)，学术出版社，第3版，1982；15：435-468)。RNase T1主要用于除去DNA抽提物中的RNA；RNA测序；核糖核酸酶保护分析，与RNase A协同作用(Sambrook，J等，分子克隆第3版，2001：7.63-7.74；除去重组蛋白抽提物中的RNA；检测“G-less cassette”DNA模板体外转录合成的RNA转录子水平(Sawadogo，M等，Proc.Natl.Acad.Sci，1985：82，4394-4398)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低拷贝基因的分离方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种低拷贝RNA基因的分离方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将含至少两种拷贝数具有极度差异的单链RNA的基因群或样品中低拷贝的至少一种单链RNA作为待分离靶基因(为正义链)，设计一段与待分离靶基因互补的相辅RNA特异性分子(为反义链)，称为驱使RNA分子(Driver RNA，DRNA)；

第二步：将第一步中所述的驱使RNA分子与待分离的单链RNA(靶基因)进行退火形成双链；

第三步：用RNA酶消化第二步所得的退火后样品；

第四步：纯化第三步所得的RNA酶未消化的双链靶基因产物，得到待分离靶基因分子。

优选地，第三步中所述的RNA酶为RNase T1。

优选地，第四步中所述的纯化方法为酚氯仿抽提/乙醇沉淀法。