[发明专利]检测过氧化氢的生物电化学传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是一种检测过氧化氢的新型生物电化学传感器及其制备方法。

技术背景

过氧化氢（H₂O₂）在食品、制药、工业、生物、临床应用和环境工程等许多领域都发挥着重要的作用，如食品加工、造纸业、消毒等。然而，过氧化氢作为一种大气污染物，是酸雨形成因素之一。此外，过氧化氢是细胞衰老、死亡以及一些病理状态细胞代谢的副产物。因此，快速、灵敏地检测过氧化氢是科学界长期以来关注的一个问题。目前，检测过氧化氢的方法主要有滴定法、分光光度法、化学发光法、荧光测定法以及电化学方法，其中电化学方法相比其他分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。

基于各种电化学方法所研制的电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极（也称对电极）和参比电极，其中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。

在各种类型的电化学生物传感器中，酶生物传感器由于酶自身的选择性和灵敏性等优点，近几年来得到了极大的发展。酶的固定方法直接决定了酶在传感器中活性的高低，从而显著地影响着酶生物传感器的检测性能。众所周知，大多数酶的催化中心深埋在酶蛋白内部，并且由于酶蛋白在电极表面的不规则定向和吸附变性等原因，酶蛋白大分子在未经修饰的电极表面表现出较慢的异相电子传递速率。为解决这一难题，研究人员发展了很多类型的修饰电极，利用各种膜材料比如表面活性剂、聚合物、脂类来固定酶蛋白，并且为酶蛋白提供一个合适的微环境来加速酶与电极之间的电子传递。然而，酶在这些修饰材料中的分布仍然是比较无序的。因此，如何使酶定向有序地固定在电极上，从而实现酶催化活性的最优化，是研制新型酶生物传感器亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测过氧化氢的生物电化学传感器，该传感器基于多肽矩阵对辣根过氧化物酶（HRP）的特异性结合及对酶活性的促进作用，实现酶传感器中酶在电极表面的特异性定向，从而达到提高传感器灵敏性的目的。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：某些特定序列的多肽可以与一些酶，如HRP的特定位点特异性结合，通过调整酶的定向，使酶的活性中心暴露在外，从而促进酶的活性。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测过氧化氢的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其中对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，其特征在于所述的金电极表面构建有多肽矩阵，辣根过氧化物酶HRP通过多肽矩阵定向固定到电极上；所述的多肽的序列为：AHKVVPQRQIRHAYNRYGSC；所述的多肽和辣根过氧化物酶的摩尔比为5：1～1：5。

一种制备上述的检测过氧化氢的生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将处理过的金电极置于0.5 M H₂SO₄中，在0-1.6 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，直至达到稳定，在氮气氛围内干燥；

b. 将步骤a所得金电极浸没在多肽溶液中，室温放置15～20小时；然后超纯水冲洗，以去除金表面未共价结合的多肽，随后，将电极浸没在含有1 mM 巯基己醇的、pH为 6.0的N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-2-乙烷磺酸HEPES溶液中0.5～1小时，用超纯水冲洗，在氮气氛围内干燥，即得到多肽修饰的金电极；所述的多肽溶液含有1 μM -10 μM 多肽，20 mM HEPES和10 mM TCEP，其pH为 6.0；

c. 在密闭状态下，将步骤b所得到的金电极浸没在1 mg/mL -10 mg/mL的HRP溶液中，室温孵育2 .5～3.5h；再用超纯水洗涤，即得到所需的工作电极；

d. 将步骤c所得到的工作电极与铂电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器。