[发明专利]肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法及PNA探针

说明书

技术领域

本发明涉及应用PNA-FISH法鉴定弧菌属的方法，尤其涉及用于鉴定重要致病性弧菌（Vibrio）的方法和PNA探针。

背景技术

我国水产动物的病害种类达200余种，常年养殖病害发病率达50%以上，损失率20%左右，估计每年因水产养殖病害问题而造成的直接经济损失就达百亿元之巨，并且还有上升的趋势。从近年来我国海水养殖病害监测报告来看，病害以生物源性疾病为主，其中又以弧菌（Vibrio）疾病为重，霍乱弧菌（V. cholerae）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（V. harveyi）、创伤弧菌（V. vulnificus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、鳗弧菌（V. anguillarum）、梅氏弧菌（V. metschnikovi）等都是重要的细菌病原。因此，发展对弧菌病原菌的快速检测和鉴定技术对于食品安全、水产养殖等均具有十分重要的意义。

肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为（2-氨乙基）甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术（FISH），与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。

发明内容

本发明的一个目的是设计了具弧菌特异性的PNA探针，本发明的另外一个目的是提供肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，实现对弧菌属的快速检测。

为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案：

肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌用PNA探针， PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA CAG。

为了验证探针的灵敏度和特异性，用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和ProbeCheck（http://www.microbial-ecology.net/probecheck）对探针进行了验证。BLAST 搜索发现，所设计的探针具有较高的特异性。但也有一些的非目标细菌与探针Vib-16S-1有重合区域，如Aliivibrio wodanis，Pantoea agglomerans，Listonella pelagia，Allomonas enterica，Listonella anguillarum，Exiguobacterium aurantiacum，Thorsellia anophelis，Antarctic bacterium，Rhodobacter capsulatus，但以上非目标细菌与弧菌关系都较疏远，也并非常见食品中的致病菌，因此一般不会导致假阳性结果。

ProbeCheck验证结果显示，探针Vib-16S-1能检测到ProbeCheck中小亚基（16S/18S）数据库中所有的2000株弧菌，但同时也能检测到635株非目标菌，其中包括352个非培养细菌，对弧菌属的特异性为99.86%，灵敏度为100%。又将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现仅有一株Arthonia didyma与之匹配，也不会与我们的目标菌混淆。

为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案：

肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，该方法包括以下的步骤：

1）离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD600=0.5-2.0,取10μl 菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；