[发明专利]一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法。

背景技术

细胞本身是由不同生物分子间相互作用形成一个有序的生命活动的基本单元。细胞重大生命活动的发生和调节是通过生物大分子间(蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等)相互作用来实现的。蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，以下简称“PPI”)不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖，同时还介导细胞生命活动过程中的信号转导、致癌转化和调整等，因此研究蛋白质-蛋白质相互作用具有重要的生命科学意义。

目前，针对哺乳动物细胞可实现活细胞内准确空间定位的PPI成像的技术，只有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)技术和双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)技术。基于荧光蛋白的BiFC技术，是指利用基因克隆技术将完整荧光蛋白在合适位点切开形成两个无荧光的片段，并使这两个片段分别与两目标蛋白构成融合蛋白，借助两目标蛋白质间的相互作用拉近这两个荧光片段的空间距离，从而重新折叠形成结构完整并具有荧光特性的融合蛋白。与FRET技术相比，双分子荧光互补技术对仪器设备的性能要求较低、实验结果更直观、后续处理简单、检测灵敏度更高、尤其在弱PPI的检测中具有优势。但现有BiFC技术均伴随着较高的假阳性率，在检测中还会产生很高的本底信号，这些缺点使得该方法在未知蛋白质间的相互作用检测和PPI的定量研究中受到限制。因此，发展低假阳性率的BiFC系统，将会极大地促进活体内的蛋白质功能研究。此外，利用基于多种不同荧光蛋白的BiFC技术可方便地实现活细胞内多对蛋白质相互作用的检测。通常，针对一对PPI进行BiFC检测时，需要同时向细胞中转染两种质粒。若同时针对三对PPI进行BiFC检测，则需要同时向细胞中转染6种质粒。显然多质粒转染过程中，不同基因的表达比例很难控制。这一问题很大程度上影响了BiFC技术在多对蛋白质相互作用检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法。利用该方法在检测蛋白质相互作用的同时，可以显著的降低BiFC的假阳性产生。

本发明所采用的技术方案是：

一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，包括以下步骤：

1)将荧光蛋白在特定位点切割成两个蛋白序列片段，荧光蛋白的N端和C端分别命名为FPN和FPC；

2)将待测目标蛋白A的DNA序列与FPN基因序列同时插入到双表达载体中的一个启动子的下游，另一个待测蛋白B和与FPC基因序列同时插入双表达载体中的另一个启动子下游，从而构建了基于双表达载体的双分子荧光互补系统；

3)将同时含有待测目标蛋白A和B的双分子荧光互补系统转染细胞，培养16～24小时以后，使用荧光显微镜观察光源刺激前后是否存在荧光；如果两目标蛋白存在相互作用，则荧光蛋白的N端和C端靠近，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号；如果没有或者只有极其微弱荧光，证明两目标蛋白之间无相互作用。

优选地，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin、黄色荧光蛋白mVenus和青色荧光蛋白mCerulean。

优选地，所述双表达载体为pBudCE4.1、pIRES2和pVITR03。

优选地，所述步骤3)中，当两目标蛋白存在相互作用，荧光蛋白的N端和C端靠近的距离范围为10nm～20nm，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号。

进一步地，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin时，特定位点为第155号丝氨酸。

进一步地，所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白mVenus时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。

进一步地，所述荧光蛋白为青色荧光蛋白mCerulean时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。

本发明具有以下优点：

本方法能够满足活细胞条件下检测蛋白质的相互作用，基于荧光蛋白的双表达载体系统，与目前常用的BiFC系统(至少两个载体分子的共同转染)相比，操作更简便，转染的载体量更易控制，每对融合蛋白的表达量更稳定，可用于蛋白质相互作用的定量分析；同时该方法显著降低了BiFC假阳性的产生，扩大了BiFC技术的应用范围，使之适用于从基因文库中快速高效地筛选出未知的蛋白质-蛋白质相互作用。

附图说明