[发明专利]一种Sublancin抗菌肽的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种Sublancin抗菌肽的生产方法。

背景技术

Sublancin抗菌肽是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生一种具有抗菌活性的内源性多肽。由核糖体合成，通过前导序列进行转录后修饰和转运。其物理性质为无色结晶或白色结晶性粉末，易溶于水。Sublancin含有二硫键，因此稳定性好。

Sublancin抗菌肽对革兰氏阳性菌具有较强抑制和杀灭作用，可应用于食品保鲜、抗感染以及抑制环境消毒。目前，国内外尚未有可实现工业化生产的Sublancin抗菌肽生产方法。关于Sublancin抗菌肽制备方法的报道也比较少。Paik等1998年(Sun H.Paik，Anu Chakicherla，and J.Norman Hansen.1998.Identification and Characterization of the Structural and Transporter Genes for，and the Chemical and Biological Properties of，Sublancin 168，a Novel Lantibiotic Produced by Bacillus subtilis 168.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.273：23134-23142.)报道了一种在实验室制备Sublancin抗菌肽的方法。菌株为B.subtilis 168，发酵规模为1L。每1L培养基含蔗糖20g，柠檬酸11.7g，Na₂SO₄ 4g，(NH₄)₂HPO₄ 4.2g，酵母提取物5g，KCl 0.762g，MgCl₂·6H₂O 0.418g，MnCl₂·4H₂O 0.0543g，FeCl₃·6H₂O 0.049g，ZnCl₂ 0.0208g，用NH₄OH调pH 6.8～6.9。发酵条件为37℃通风培养16h后，200rpm摇床37℃培养28h。纯化方法为：用磷酸调发酵培养液pH2.5；离心除去细胞；过25ml体积疏水层析柱；冻干；用0.1％的三氟乙酸溶解后离心去掉沉淀；经过2次HPLC反相C-18分析柱的分离纯化后，经冻干，于-20℃保存。该方法发酵规模小，产量低而且不稳定。纯化过程采用了高精密仪器高效液相色谱(HPLC)，对化学试剂以及操作人员的要求都比较高，这就导致采用此方法精制Sublancin抗菌肽成本高，产量低的特点。因此，上述方法不适用于大规模生产，不能满足工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度Sublancin抗菌肽的发酵生产和纯化的方法，以克服现有技术中没有工业化生产高纯度Sublancin抗菌肽的不足。

本发明通过大量研究，对一系列工艺数据进行探索，通过技术革新，优化了发酵配方和工艺，扩大发酵规模，提高了Sublancin抗菌肽的产量，降低了生产成本，摸索出一套可以大规模生产Sublancin抗菌肽的发酵方法；并进行了纯化过程的设计、组合，解决了纯化对高精密仪器的依赖和产量低的问题，使Sublancin抗菌肽的纯化满足规模化生产的要求，通过一系列层析技术实现Sublancin抗菌肽的大量纯化，最终实现高纯度Sublancin抗菌肽的工业化制备。

Sublancin抗菌肽纯物质的纯化制备流程见图1。

本发明提供了一种Sublancin抗菌肽的制备方法，所述生产方法包括：

(1)枯草芽孢杆菌接种培养基进行发酵，过滤发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液离心，通过阳离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析，最后超滤浓缩、干燥，即得Ssublancin抗菌肽。

其中，步骤(1)中所使用的菌株为B.subtilis CVCC20076，发酵液通过陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜孔径为20nm。