[发明专利]鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是鸡及其它禽类慢性呼吸道疾病的主要病原，感染鸡群常出现啰音、咳嗽、流鼻涕等症状，可引起鸡生长速度下降，肉鸡胴体品质下降和种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，给养禽业造成较大的经济损失。MG在世界各国广泛存在，我国鸡群中MG的感染率很高，郭锐等通过对湖北、河南两地38个鸡场的162只患呼吸道疾病的鸡进行支原体的分离，结果59个分离物被鉴定为鸡毒支原体。邓显文等对广西不同地区鸡场调查中发现，鸡群MG平均感染率为56.9％。MG既可水平传播，也可经种蛋垂直传播，长期存在于鸡群中，给该病的防控带来困难。目前，防治MG的最有效方法，就是应用弱毒疫苗或灭活油乳剂苗进行预防接种，但鸡群中使用弱毒疫苗，会导致鸡群长期受到疫苗株的污染，干扰MG的检测，影响到鸡群MG的控制和净化，因此，建立一种特异、敏感、快速的鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的检测方法是非常必要的。

传统的MG诊断方法有病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，无法快速鉴别MG强毒株和弱毒株，毒力的测定要通过鸡胚接种和SPF鸡感染等致病性试验，费时、成本比较高，无法满足生产实际的需要。在鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的PCR检测方面，邓显文等根据MG强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点，分别设计合成2对引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。谢芝勋等根据对邓显文等设计的引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，进一步建立了一种多重聚合酶链反应快速鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的方法，即在数小时内，一次多重PCR反应，就能同时检测鉴别MG强、弱毒株的技术。但这些鉴别检测方法存在耗时长、敏感性较低、并且常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，不能确定鸡毒支原体感染的含量。

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种在等温条件下高特异、高效、快速的扩增靶序列的DNA扩增新技术，依赖Bst DNA聚合酶在60-65℃具有核酸双链解链功能和瀑布式核酸扩增功能，进行自动的成环链置换及DNA合成，不需要特殊的仪器设备，仅在可控温水浴锅中45min-60min内即可完成全部反应，反应后，不需打开PCR反应管，肉眼观察颜色，直接判定结果，具有特异性好、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、不会造成PCR产物的污染(不需要EB染色)等优点，省时省力，应用前景广阔。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增引物组A。

本发明提供的引物组A，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组A还包括引物5和引物6；

上述引物5和上述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

上述引物组A由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成；

上述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比具体为(7-9)∶(7-9)∶1∶1∶(3-5)∶(3-5)，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比进一步具体为8∶8∶1∶1∶4∶4。

本发明的第二个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂A。

本发明提供的试剂A，由上述的引物组A、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、氯化锰和水组成；

上述的引物组A中的引物1在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

上述的引物组A中的引物2在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

上述的引物组A中的引物3在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

上述的引物组A中的引物4在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

上述的引物组A中的引物5在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.6umol/L-1umol/L；