[发明专利]一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，具体涉及一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用。

背景技术

代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，通过组群指标分析，进行高通量检测和数据处理，研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化，特别是对内源代谢、遗传变异、环境变化乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响。其常用的分析技术为气相色谱-质谱联用(GC/MS)技术、液相色谱-质谱联用(LC/MS)技术和核磁共振(NMR)等。其中气-质联用在代谢组学研究中被称作代谢物分析的“黄金标准”(参见文献1：Fischer E，Sauer U.Metabolic flux profiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS.European Journal of Biochemistry，2003，270(5)：880-891.参见文献2：Zimmermann D，Hartmann M，Moyer M P，et al.Metabolomics of human colon cell lines.Metabolomics，2007，3(1)：13-17.)，但采用GC/MS进行分析，大多数样品都需要在室温或升温的条件下进行衍生化处理，传统的血浆代谢组学样品前处理条件为35℃下肟化2h后再在70℃下衍生化反应1h(参见文献3：简伟雄，袁肇凯，黄献平，等.冠心病心血瘀阻证血浆代谢组学的检测分析，中国中西医结合杂志，2010，30(6)：579-584)，这不仅工作量大而且耗时、效率低。

已有文献报道微波能促进有机化学反应(参见文献4：樊兴君，尤进茂，谭干祖，等.微波促进有机化学反应研究进展，化学进展，1998，10(3)：285-295)，采用微波辅助衍生化来有效地缩短衍生化时间，但对于耗时最长的肟化反应并未缩短，仅靠微波辅助衍生化并不能完全提高效率。

目前国内外尚无文献报道在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。

本发明在微波能有效促进化学反应的前提下，尝试采用微波技术辅助肟化来进一步缩短血浆样品处理时间，从而更有效地提高效率。本发明的技术方案即同时采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理，然后结合GC/MS法进行血浆代谢组学研究。

本发明采用Box-Behnken(参见文献5：S.L.C.Ferreira，R.E.Bruns，H.S.Ferreira，et al.Box-Behnken design：An alternative for the optimization of analytical methods.Analytica Chimica Acta，2007，597：179-186.)设计优化法来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。具体操作为取血浆样品按如图1所示的微波辅助方法与传统方法分别处理样品，并以传统方法作为参考，同时按表1所示采用Design-Expert8.0.5b软件进行实验设计，然后对所得数据进行处理，面积归一化后，将微波辅助肟化、衍生化方法所得的数据与传统方法所得数据进行相关性分析，以相关系数为指标，对各因素进行拟合，结果如表2所示；绘制各指标与两个自变量的三维曲面图，另外两个变量取中值，如图2a-f所示。根据所得结果，采用Design-Expert8.0.5b软件得到理论的优化方案。以本发明的微波辅助方法与传统方法的相关系数为指标(越接近1越好)来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。微波技术辅助肟化技术优化条件为：加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；微波技术辅助衍生化技术优化条件为：加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应。

本发明提供了一种微波辅助血浆样品前处理方法，该方法是将血浆样品去蛋白处理后，加入肟化反应试剂，混匀，密闭，在微波能量为60～73W的条件下微波辅助肟化75～125s后；加入衍生化试剂，在微波能量为200～260W的条件下微波辅助衍生化150～210s。

上述的微波辅助血浆样品前处理方法，其中的肟化反应试剂是甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，加入量与血浆样品的体积比为1∶2。