[发明专利]构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法。

背景技术

富马酸是一种重要的四碳有机酸，酸度为柠檬酸的1.5倍，因含有一个双键，二个羧基的特殊分子结构，富马酸可进一步通过氨化、水合、加氢、异构、聚合等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、聚合物等，使其成为重要的平台化工原料而被广泛应用于树脂、涂料、增塑剂、食品、饲料等领域。目前，市场上所售的富马酸主要通过石化法获得，随着石油资源的不断消耗和石油价格的持续波动，以及化学法制备过程所产生的环境污染等原因，富马酸产业的可持续发展面临严峻的挑战。

现有技术报道的能够产生富马酸的微生物有霉菌、酵母和细菌，其中根霉菌被作为重点研究对象。近年来，发酵法制备富马酸的研究主要集中于菌种选育、培养条件优化及廉价底物的利用。Kang以紫外和γ射线诱变米根霉，筛选获得了一株富马酸产量提升1.9倍的突变株，5 L发酵罐水平为32.1 g/L。Zhou等通过优化米根霉种子培养过程，获得了较为理想的菌球状形态，在此条件下，富马酸产量为38.2 g/L。Fu等开发了双阶段溶氧调控的策略，富马酸产量达56.2 g/L，且过程能耗得到显著降低。Xu等采用双阶段利用木质纤维素的工艺路线，最终富马酸产量达27.7 g/L。

发酵法制备富马酸以可再生生物质资源为原料，不仅摆脱了对石油基资源的过分依赖，且过程温和，可控性强，有力的保证了富马酸产业的可持续发展。但常用的根霉菌生长速度缓慢、产品生产强度偏低、成本相对较高，且根霉菌遗传背景不清晰，基因操作难度大。故开发营养要求简单、生长迅速、生产强度高、背景清晰的富马酸生产菌株，是加速生物法替代石化法生产的关键。

大肠杆菌具有生长快速、培养条件简单、遗传背景清晰、价格低廉等诸多优点，利用大肠杆菌发酵生产有机酸是近年来研究开发的热点。Soon Ho Hong等人敲除了野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶基因，减少了副产物甲酸、乳酸、乙酸及乙醇的积累，促进了丁二酸的生成。大肠杆菌具有富马酸的代谢途径，但一般不过多积累，要提高其产富马酸的能力，对现有菌株进行基因改造是重要途径。

关于利用基因工程菌产富马酸已有报道，刘立明等以光滑球拟酵母为宿主，过量表达来源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因和富马酸酶基因，获得了一株产富马酸的工程菌，发酵液中富马酸产量达35 mg/L。姜岷等通过敲除富马酸还原酶（FRD）基因，过量表达苹果酸酶后，获得了产富马酸的大肠杆菌基因工程菌。但上述研究所涉及的富马酸基因或外源导入，或为混合酸途径中的相关基因，尚未见通过强化TCA中相关基因促进富马酸生成的相关报道。

发明内容

本发明的技术目的在于提供一种构建高产富马酸的基因工程菌株的方法，使得构建的菌株能厌氧高产富马酸。

为了实现本发明的技术目的，本发明采用以下的技术方案。

一、一种构建产富马酸大肠杆菌（Escherichia coli）基因工程菌的方法，以大肠杆菌出发菌株，敲除其TCA循环途径中编码的富马酸酶（FUM）基因以阻断富马酸至苹果酸的转化途径；以及敲除抑制其TCA循环途径中的TCA循环抑制蛋白基因（arcA）实现厌氧条件下TCA循环的正常运作，得到可实现厌氧途径下富马酸高效积累的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。

需要特别指出的是：上述敲除富马酸酶（FUM）基因和敲除TCA循环抑制蛋白基因（arcA）的步骤不分先后完成，即可以先敲除FUM基因再敲除arcA；而可以先敲除arcA再敲除FUM基因；两种顺序均能得到所述的产富马酸大肠杆菌基因工程菌。

进一步地，所述的方法还包括以下步骤：敲除富马酸还原酶（FRD）基因、丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）基因和乳酸脱氢酶（LDH）基因中的一种或多种。其中，敲除富马酸还原酶（FRD）基因，目的是阻断富马酸至丁二酸的转化，减少杂酸丁二酸的生成；敲除丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）基因，目的是降低代谢途径中甲酸生成；敲除乳酸脱氢酶（LDH）基因，降低代谢途径中乳酸生成。

其中，本发明所述的敲除其TCA循环途径中编码的富马酸酶（FUM）基因的方法，包括敲除FUM基因的完整基因片段，或者敲除FUM基因的亚基部分。例如，本发明所述的出发菌株E. coli MG1655的FUM基因涉及fumA、fumB、fumC三种亚基。