[发明专利]一种增强型肿瘤特异性治疗载体

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤治疗载体技术领域，涉及一种增强型肿瘤特异性治疗载体。

背景技术

肿瘤基因治疗是目前肿瘤治疗的新方向。基因治疗载体的表达、特异性及靶向性都是其疗效成败的关键因素。以往的基因治疗载体因缺乏肿瘤特异性或靶向性表达，而不可避免地对正常组织产生毒副作用，造成机体损伤，所以提高载体的靶向性是肿瘤基因治疗的研究热点。

目前已有应用针对只在肿瘤组织中特异表达的survivin启动子联合厌氧反应元件HRE的肿瘤特异性表达载体(L Yang，，Z Cao，，F Li，et al.Tumor-specific gene expression using the surviving promoter is further increased by hypoxia.Gene Therapy，2004，11：1215-1223)，然而在后续的研究中发现单纯survivin启动子联合厌氧反应元件HRE表达载体的表达效率远远不够。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种增强型肿瘤特异性治疗载体，在对肿瘤细胞特异杀伤的基础上，进一步提高其表达效率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种增强型肿瘤特异性治疗载体，包括厌氧反应元件和survivin启动子，在survivin启动子的上游还设有CMV增强子。

所述的CMV增强子为Enhancer，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的厌氧反应元件为多个串联的厌氧反应元件HRE。

所述的多个串联的厌氧反应元件HRE为5个HRE的串联，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的survivin启动子的下游设有包括多克隆位点和PloyA尾的miRNA串联表达框；

所述的多克隆位点至少包括EcoRI、PstI、NheI、kpnI和HindIII酶切位点。

所述的survivin启动子与miRNA串联表达框之间还设有荧光标记基因，在miRNA串联表达框的下游设有抗生素筛选基因。

所述的多克隆位点之间插入有沉默ERK1/2的肿瘤管家基因ERK。

所述的增强型肿瘤特异性治疗载体为pMD-HRE₅-Enhancer-SURV/EmGFP-miR，该载体是在pMD19-T载体的Amp和ori之间依次连接五个串联的低氧反应元件HRE₅、CMV增强子Enhancer、survivin启动子、GFP和miRNA表达框架。

所述的pMD-HRE₅-Enhancer-SURV/EmGFP-miR载体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的增强型肿瘤特异性治疗载体在制备抗肿瘤药物的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的增强型肿瘤特异性治疗载体，首先通过肿瘤特异性启动子survivin promoter和厌氧反应元件(HRE)的双调控，使得该载体在肿瘤组织特异性表达，避免其对正常组织的损伤；其次通过CMV增强子的调控，提高其在肿瘤组织的特异性表达，提高载体在肿瘤中的表达能力；细胞转染结果表明设有增强子的载体表达效率远高于无增强子的表达载体；

而且鉴于肿瘤的发生是多基因共同作用的结果，单纯针对某一靶基因的治疗效果往往不是十分理想，本发明提供的增强型肿瘤特异性治疗载体的miRNA串联表达框中设计了5个不同的酶切位点，这样就可实现插入多个针对肿瘤的管家基因的siRNA或miRNA，使得串联的siRNA或miRNA同时表达，达到对肿瘤的多靶点治疗。

在miRNA串联表达框中插入针对肿瘤管家基因ERK的ERK1/2 shRNA进行肿瘤基因治疗，结果表明该载体对肝癌HepG2细胞，恶性黑色素瘤A375细胞都有很好的肿瘤抑制效应。

附图说明

图1为pMD-HRE₅-Enhancer-SURV/EmGFP-miR表达载体结构示意图；

图2为HRE₅扩增后的电泳鉴定结果；

图3为survivin启动子扩增后的电泳鉴定结果；

图4为miRNA表达框扩增后的电泳鉴定结果；

图5为Enhancer扩增后的电泳鉴定结果；

图6为HepG2细胞转染后的荧光照片图；