[发明专利]适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其应用，特别涉及一种适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用。属于生物技术领域。

发明背景

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其组成成份包括碳水化合物、血浆蛋白、多肽、脂肪、生长因子、激素、无机物等，这些物质是通过促进细胞生长或抑制细胞生长活性从而达到生理平衡的。除此之外，血清还提供除营养物质外的激素、生长因子，转运大分子的结合蛋白以及能够促使细胞贴壁并免受机械损伤的促接触和伸展因子。

在常规细胞培养中，血清是一个不可或缺的成分，但仍存在一些问题。比如：成份复杂，不同批次之间差异明显；而且对于大多数细胞，血清不是它们在体内的常规内环境，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能会改变某种细胞在体内的正常状态。

无血清培养作为一种新兴的细胞大规模培养方案，在避免了上述采用有血清培养基培养的缺点的同时，并有一些新的特性，例如培养液成分明确，不同批次之间各成分含量没有差异等，这些特性提高了培养基的稳定性和实验数据的一致性，并简化了纯化和下游加工的过程；另外，无血清培养基不含动物源性大分子蛋白，避免了细胞水平和机体水平不必要的副作用(如疫苗过敏反应)。

重组腺病毒载体作为一种基因转移载体系统，具有安全、病毒增殖滴度高、基因转移效率高、宿主谱广等优点，在疫苗开发、基因治疗等方面得到广泛应用。但现行的腺病毒生产工艺存在产量低、纯化困难、依赖血清培养等缺点。

发明内容

为了解决以上问题，本发明发明人驯化了一株能高效包装腺病毒的无血清细胞系。本发明以HEK293细胞为原始材料，筛选了一株适应无血清培养的细胞系，并研究了其产毒性能和稳定性。

本发明的一株适应无血清培养的HEK293细胞系，其特征在于所述HEK293细胞系命名为293SF，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.5824，保藏日期为2012年2月29日。

本发明还提供了一种建立以上所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)HEK293细胞进行适应培养前，采用10％FBS DMEM对其进行培养，细胞铺满培养瓶底面时用含0.25％EDTA的胰酶消化，1500r/min离心5min收集细胞，用适应液稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL，进入适应阶段；

(2)适应过程中采用培养液渐进替换的方法，按照以下步骤进行适应培养：

第1步：用含有25％的无血清培养基293 SFM II和75％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第2步：用含有50％的293 SFM II培养基和50％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第3步：用含有75％的293 SFM II培养基和25％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第4步：用含有87.5％的293 SFM II培养基和12.5％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第5步：用含有95％的293 SFM II培养基和5％的含10％的牛血清DMEM培养基，根据细胞状态，传代3～5次；

第6步：当第5步细胞生长快速、状态良好后，更换为100％的293 SFM II培养基传代，得到适应无血清培养的293SF细胞系。

在本发明的方法中，其特征在于在适应过程中，当细胞密度＞1×10⁶个细胞/mL时，以3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养；完全更换为100％的293SFM II培养基后，当细胞密度达到1×10⁶～3×10⁶个细胞/mL时，以5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。

在本发明的方法中，其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化；当适应液中293 SFM II的比例达到95％时，停止使用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。

在本发明的方法中，其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无血清培养后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培养液在培养条件为37℃、8％CO₂的培养箱中培养。