[发明专利]适应无血清培养的HEK293细胞系及其应用

权利要求书

1.一株适应无血清培养的HEK293细胞系，命名为293SF，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5824。

2.建立权利要求1所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)HEK293细胞进行适应培养前，采用10％FBS DMEM对其进行培养，细胞铺满培养瓶底面时用含0.25％EDTA的胰酶消化，1500r/min离心5min收集细胞，用适应液稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL，进入适应阶段；

(2)适应过程中采用培养液渐进替换的方法，按照以下步骤进行适应培养：

第1步：用含有25％的无血清培养基293 SFM II和75％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第2步：用含有50％的293 SFM II培养基和50％的含10％牛血清DMEM培养基，传代2次；

第3步：用含有75％的293 SFM II培养基和25％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第4步：用含有87.5％的293 SFM II培养基和12.5％的含10％牛血清DMEM培养基，传代3次；

第5步：用含有95％的293 SFM II培养基和5％的含10％的牛血清DMEM培养基，根据细胞状态，传代3～5次；

第6步：当第5步细胞生长快速、状态良好后，更换为100％的293 SFM II培养基传代，得到适应无血清培养的HEK293细胞系。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于在适应过程中，当细胞密度＞1×10⁶个细胞/mL时，以3×10⁵～5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养；完全更换为100％的293 SFM II培养基后，当细胞密度达到1×10⁶～3×10⁶个细胞/mL时，以5×10⁵个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化；当适应液中293 SFM II的比例达到95％时，停止使用胰酶，改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无血清培养后，采用含有400mmol/L GlutaMAX-I的293 SFM II培养液在培养条件为37℃、8％CO₂的培养箱中培养。

6.培养权利要求1所述的HEK293细胞系的方法，其特征在于，所述的方法分为贴壁培养和悬浮培养两种；

用于贴壁培养时，在培养细胞前，使用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶促使适应无血清培养的细胞贴壁，具体操作如下：用去离子水配制的PBS缓冲液稀释多聚赖氨酸至0.1mg/ml，经0.22μm滤膜过滤备用；将2ml多聚赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中，摇动培养瓶使液体铺满瓶底，放入37℃培养箱中孵育6小时后取出，处理后的培养瓶即可用于所述的HEK293细胞系的培养；

用于悬浮培养时，直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。

7.权利要求1所述的HEK293细胞系在表达外源蛋白中的应用。

8.权利要求1所述的HEK293细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。