[发明专利]结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；分枝杆菌全自动培养系统(Bactec MGIT 960)虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。目前，结核病诊断广泛应用皮试检测试剂---结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)，然而PPD存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低，故改进和创新势在必行。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法及其应用，可有效解决结核病的诊断检出率低，费用高，操作复杂及诊断试剂效果差的问题。

本发明解决的技术方案，该结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法，由以下步骤实现：

(1)、根据Rv3117基因序列(Rv3117基因序列NCBI登陆号为BX842582.1；蛋白号为：CAB08374.1，)来设计靶基因引物；

(2)、以结核分枝杆菌菌株基因组DNA为模板，PCR扩增，得PCR产物，PCR产物经纯化后得Rv3117基因纯化序列，双酶切，得酶切产物；

(3)将酶切产物插入至表达质粒(表达质粒又称载体)中和酶切Rv3117基因纯化序列所用的限制内切酶相对应的酶切位点处，采用常规方法克隆构建重组质粒，测序表明重组质粒的基因序列与GenBank(基因组库)中H37Rv结核全基因组中对应基因序列(Rv3117基因NCBI登陆号为BX842582.1；蛋白号为：CAB08374.1)完全一致；

(4)将构建的重组质粒转化入和表达质粒相匹配的宿主细胞中进行蛋白表达，得表达蛋白Rv3117；

(5)诱导表达蛋白Rv3117，得诱导表达产物；

(6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3117重组蛋白(SEQ ID NO：1)，Rv3117重组蛋白的基因序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)上的CAE55554.1蛋白序列相比，加入了表达质粒相关序列和纯化标签，如，使用pET32a表达质粒时，重组蛋白后面加了pET32a上的相关序列和一段His Tag纯化标签；

本发明的Rv3117重组蛋白可以单独作为检测结核病的诊断试剂；

本发明提供了一种含有Rv3117重组蛋白的检测结核病的试剂盒，该试剂盒是基于抗原抗体反应原理制备的试剂盒，如抗原抗体反应结果呈阳性，则认为该检测者患有结核病，抗原抗体反应包括且不仅限于凝集反应，或沉淀反应，或免疫荧光技术，或E花环反应，或ELISA反应等；

本发明还提供了一种通过包含有Rv3117重组蛋白以检测特异性抗体的结核病诊断试剂盒；本发明上述含有Rv3117重组蛋白或含有Rv3117重组蛋白的特异性抗体的检测结核病的试剂盒中，还包括：

(1)包被稀释液：pH9.6浓度0.05M的碳酸盐缓冲液(常用市售分子生物学试剂)；

(2)PBST洗涤缓冲液(常用市售分子生物学试剂)；

(3)样本稀释液：含1％BSA的PBST(常用市售分子生物学试剂)；

(4)经标记的二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG或辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM；

(5)阳性对照品和阴性对照品；

(6)底物溶液：底物缓冲液A：乙酸钠2.4g，柠檬酸0.28g依次加入，溶于88ml超纯水(Millipore，US，以下同)，在磁力搅拌器中搅拌溶解，加入53μl 30％H₂O₂(过氧化氢溶液)，磁力搅拌器搅拌溶解；底物缓冲液B：80ml超纯水中加入0.03g TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)和0.32g EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠，常用市售分子生物学试剂)，然后再加入8ml甘油，搅拌，溶解；

(7)终止液：2M硫酸；

(8)96孔酶标板(Costar，US)；