[发明专利]结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白，其特征在于，Rv3117重组蛋白的序列为SEQ ID NO:1。

2.一种结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、根据Rv3117基因序列来设计靶基因引物；

（2）、以结核分枝杆菌菌株基因组DNA为模板，PCR扩增，得PCR产物，PCR产物经纯化后得Rv3117基因纯化序列，双酶切，得酶切产物；

（3）将酶切产物插入至表达质粒中和酶切Rv3117基因纯化序列所用的限制内切酶相对应的酶切位点处，采用常规方法克隆构建重组质粒，测序表明重组质粒的基因序列与GenBank中H37Rv结核全基因组中对应基因序列Rv3117基因完全一致；

（4）将构建的重组质粒转化入和表达质粒相匹配的宿主细胞中进行蛋白表达，得表达蛋白Rv3117；

（5）诱导表达蛋白Rv3117，得诱导表达产物；

（6）分离纯化诱导表达产物，得到Rv3117重组蛋白SEQ ID NO:1，Rv3117重组蛋白的基因序列与NCBI上的CAE55554.1蛋白序列相比，加入了表达质粒相关序列和纯化标签，即使用pET32a表达质粒时，重组蛋白后面加了pET32a上的相关序列和一段His Tag纯化标签；

所述的表达质粒为pET21a、pET32a、pET28b、pET30a或pET32a中的一种；所述的宿主细胞为大肠杆菌的BL21 DE3菌株或BL21 DE3 physS菌株；所述的结核分枝杆菌菌株基因组DNA为结核分枝杆菌H₃₇Rv基因组DNA；所述的Rv3117基因序列包括对BX842582.1中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列，由于密码子的简并性，所以与BX842582.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的结核分枝杆菌Rv3117重组蛋白的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

1）、重组质粒pET32a-Rv3117的构建

（1）靶基因引物设计

Rv3117-F：5’-CATACCATGGCACGCTGCGAT -3’;

Rv3117-R：5’- CTTCTCGAGTCAGCTTCCCAA -3’;

酶切位点分别为Nco I、Xho I；

（2）靶基因的PCR扩增、克隆及序列测定

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因组DNA为模板，Rv3117-F为上游引物和Rv3117-R为下游引物，应用Taq酶，通过PCR扩增，得PCR产物， PCR扩增的反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存，然后用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用DNA回收试剂盒回收，得Rv3117基因纯化序列，将Rv3117基因纯化序列用限制内切酶Nco I和限制内切酶Xho I酶切，插入到pET32a表达质粒的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点中，克隆构建重组质粒pET32a-Rv3117，测序表明重组质粒pET32a-Rv3117的基因序列和GeneBank中H37Rv结核全基因组相应基因序列完全一致；

2）重组质粒pET32a-Rv3117的诱导表达及纯化

取100ul BL21 DE3 physS感受态细胞装入eppdorf 管，放入冰上，3-5分钟管内液体融化后，将0.5ul测序正确的重组质粒pET32a-Rv3117转化入感受态细胞中进行蛋白表达，冰上放置45min，42℃水浴锅中，热击90s，冰上静置3min，得表达蛋白Rv3117，在表达蛋白Rv3117中加入500ul的不含抗生素的LB培养基，37℃摇床，220rmp，培养45-60min，然后取100ul在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，18-25℃干燥后，倒置于37℃温箱中培养10－12小时，挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37℃培养OD值至0.4-0.7，加入终浓度为10mM 的IPTG诱导剂，37℃ 诱导3h，收集诱导后的菌体，按10ml 洗涤缓冲液 I每克菌体的比例重悬后超声破碎，得混合液，取混合液10000g 离心30min，收集含目的蛋白的上清液，用IMAC亲和色谱柱Bio-Rad进行亲和纯化，即先用2CV 去离子水冲洗2ml/min，3min，5CV 的洗涤缓冲液 I平衡亲和柱，再取6CV包含目的蛋白的上清液上样，依次用6CV洗涤缓冲液 I冲洗，2ml/min，3min，6CV洗涤缓冲液 Ⅱ冲洗，2ml/min ，3min，10CV 的洗涤缓冲液 Ⅲ洗脱2ml/min ，5min，收集洗脱液，得纯化的目的蛋白，再用pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液透析，得目的蛋白液，用10 kDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，得浓缩的目的蛋白，用 BCA法测定浓缩的目的蛋白的浓度， SDS-PAGE电泳分析目的蛋白纯度为95%，即得Rv3117重组蛋白SEQ ID NO:1；所述的洗涤缓冲液 I是由KCl：300mM、 KH2PO4：50mM、咪唑：5mM混合组成；所述的洗涤缓冲液 Ⅱ是由KCl：300mM、KH2PO4：50mM、咪唑：10mM混合组成；所述的洗涤缓冲液 Ⅲ是由KCl：300mM、KH2PO4：50mM、咪唑：250mM混合组成。