[发明专利]一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法。

背景技术

猪流感（Swine influenza，SI）由流感病毒属A型流感病毒中的猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起，是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一。该病典型临床症状为发热、厌食、体重减轻、精神萎靡、流涕、咳嗽以及呼吸困难等。其单独感染时病死率较低，但该病常与其他传染病混合感染，如传染性胸膜肺炎放线杆菌等，使病情加重，大大的提高了病死率。

常见的流感病毒的受体有两种：一种为唾液酸 α-2,3 半乳糖（SAα-2,3-Gal），另一种为唾液酸 α-2,6 半乳糖（SAα-2,6-Gal）。不同流感病毒的 HA 受体特异性有所不同，多数禽流感病毒优先结合 SAα-2,3Gal，而人流感病毒则优先结合 SAα-2,6-Gal，猪流感病毒则对 SAα-2,3-Gal 与 SAα-2,6-Gal 均具有相同的结合能力。猪呼吸道上皮细胞表面同时存在人和禽流感病毒受体 SAa-2,6-Gal 和 SAa-2,3-Gal，因此猪可被禽流感病毒和人流感病毒感染，同时 SIV 也具有感染人和禽的潜力。由此，猪成为了流感病毒基因重组或重配的“混合器”，不同亚型、不同宿主之间的A 型流感病毒在猪体内进行重组，产生各种新的病毒株。20世纪以来人类每次流感大流行爆发的前后都伴随着SI的发生与流行，猪在流感病毒种间传播链中所起的作用不容忽视。2009年甲型 H1N1 流感病毒的产生就是其中的一例，该毒株的产生导致了大量人群的死亡。所以加强对SIV的检测不仅在兽医界具有重要意义，对人流感的研究也有一定的意义，可以最大限度的降低人流感大流行再次爆发的可能性，对人类的生命安全具有长远的公共卫生学意义。

核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种分子生物学扩增新技术。是一种特异性等温扩增RNA的技术，是基于一个等温扩增酶系统，包括AMV逆转录酶(AMVRT)、RNaseH和T7RNA聚合酶。以RNA为模板，在AMV逆转录酶和引物Ⅰ的作用下合成cDNA，引物Ⅰ的5′端带有T7启动子序列，然后引物Ⅱ与cDNA链退火合成cDNA链的互补链，进而形成了含完整T7启动子序列的双链DNA。T7RNA聚合酶以此双链DNA为模扳，合成大量拷贝的RNA片段。1991年，compton J首先介绍了该方法。与普通PCR不同的是，NASBA是由带有T7启动子序列的引物引导的、等温的核酸扩增技术。反应在41℃进行，能在1-2h内将模板RNA扩增10⁹倍，且不需特殊仪器，是一种快速、简便、特异的扩增技术。

猪流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组由8个分节段的RNA组成，其中核蛋白（NP）基因相对保守，通过对A、B、C三型流感病毒NP蛋白氨基酸序列比对结果表明：A和B型流感病毒的NP蛋白具有很高的同源性。同时，来自不同宿主A型流感病毒株的系统发育树也表明NP基因相当保守，毒株之间最大氨基酸差别不超过11%。因此核蛋白经常作为流感病毒型的分类和诊断的候选基因。本发明以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，为猪流感的防控提高技术支撑，保障养猪业的健康、快速发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猪流感病毒的NASBA。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案：

一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性扩增引物，其特征在于所述的扩增引物如SEQ NO：1，SEQ NO：2所示。

本发明进一步公开了采用SEQ NO：1，SEQ NO：2特异性扩增引物检测猪流感病毒NASBA的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取病毒RNA：使用TRIZOL 试剂提取RNA；

（2）NASBA扩增体系：

将待检样品RNA  3μl；

缓冲液          4μl

10mM/L dNTP    2μl

20mM/L NTP     2μl 

DMSO           1μl

引物NP-T7       2μl

引物NP-DET     2μl

（3）NASBA扩增程序：