[发明专利]一种用于检测猪流感病毒的NASBA方法

权利要求书

1.一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性扩增引物，其特征在于所述的扩增引物如SEQ NO：1，SEQ NO：2所示。

2.一种采用权利要求1所述的特异性扩增引物检测猪流感病毒NASBA的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取病毒RNA：使用TRIZOL 试剂提取RNA；

（2）NASBA扩增体系：

将待检样品RNA  3μl；

缓冲液          4μl

10mM/L dNTP    2μl

20mM/L NTP     2μl 

DMSO           1μl

引物NP-T7       2μl

引物NP-DET     2μl

（3）NASBA扩增程序：

在DNA扩增仪上65℃加热5min，41℃冷却5min，迅速加入4μl酶混合液，41℃反应90min；4℃终止反应；

（4）NASBA 扩增产物鉴定

1）将部分猪流感分离株的NASBA扩增产物稀释10倍，作为模板进行反转录后；

2）反转录体系：5X RT buffer  4μL、2.5mmol  dNTP4μL、Random Primer 1μL、RNase inhibitor 0.5μL、AMV 1μL、10倍稀释的NASBA扩增产物 9.5μL；

3）反转录程序： 将反转录反应管在PCR仪上按以下程序反应： 

30℃，10min，42℃，1h，99℃，5min，迅速降温到4℃；

（5）PCR扩增   

1）引物：

NP-DET：5′-GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3′

NP-T7：5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3′

2）PCR反应体系：10XRT-PCR buffer 2μL、Mgcl₂ 1μL、dNTP  2μL、NP-DET 1μL、NP-T7  1μL、taq 0.5μL、反转录产物9.5μL、水 3μL；

3）PCR扩增程序：将PCR反应管放入在PCR仪上按以下程序反应：95℃反应5min后；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，三个温度循环反应35个循环；72℃ 10min，4℃ 终止反应；

4）PCR结果观察：用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中所指的缓冲液为含40mM/L  PH8.5 Tris-HCL，70mM /L KCl，12mM/L MgCl₂，5mM/L DTT缓冲液。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤（3）中所指的酶混合液包含1～2U AMV，0.2～0.5U RNaseH，30～50U T7 RNA 聚合酶，2~6μl 1mg/mlBSA。