[发明专利]产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用，具体是指产丁醇基因工程菌构建及其构建得到的一株菌株，还涉及利用该菌株发酵生产丁醇的方法。

背景技术

丁醇是一种重要的有机溶剂和精细化工原料，也是一种洁净的可再生能源，目前丁醇在美国的市场已达到每年1300万吨。由于丁醇的化学合成法的原料是以石油为基础的丙烯，随着石油价格的迅猛增长，石油化工生产丁醇成本也随之增长，因此生物发酵法生产丁醇受到广泛关注。

目前生物发酵法（ABE发酵法）生产丁醇主要通过丙酮丁醇梭菌属发酵产生，包括Clostridium acetobutylicum，C. beijerinckii，C.pasteurianum，C. saccharoperbutylacetonicum，C. tetanomorphum， C. saccharoacetobutylicum等。随着生物技术、代谢工程、基因工程技术的飞速发展，采用分子生物学手段，构建遗传稳定的基因工程菌生产丁醇成为研究的热点，除了对产丁醇梭菌进行遗传改造之外，还在其他微生物系统中重构丁醇代谢途径，如大肠杆菌等。现有技术中，利用基因工程技术对大肠杆菌的代谢途径进行加工改造，构建的大肠杆菌工程菌已能够产生丙酮、丁醇。Bermejo等人构建了一个包含基因cet4 ( adhe , etf AB和thil )的质粒pACT，并转入大肠杆菌，首次构建了产丙酮的大肠杆菌工程菌，发酵后能够产生2.32 g/ L的丙酮；Inui等将来源于丙酮丁醇梭菌ATCC 824中合成丁醇途径的关键基因thil、hbd、crt、bcd-etfB-etfA、adhE，分别编码硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶和醛/醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，酶的活性有所改变，基因工程菌发酵后产生1.18 g/ L丁醇；Nielsen等在E.coli中构建了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢路径，直接表达多顺反子能够得到34 mg/L丁醇，分别表达单独顺反基因，丁醇产量能达到200 mg/L，若同时表达酵母甲酸铵脱氢酶基因，及过表达大肠杆菌的3-磷酸脱氢酶，丁醇产量可提高到580 mg/L；Shen等人在大肠杆菌中构建了经过修饰的丙酮丁醇梭菌代谢途径，得到了Ter（酰基CoA转移酶）催化的不可逆转反应产生了NADH和乙酰辅酶A驱动力，并使用气提手段使重组菌株厌氧发酵能够产生30 g/ L的丁醇。上述现有技术表明克隆丁醇合成中编码关键酶的基因，进一步在大肠杆菌中进行表达，构建的大肠杆菌工程菌能够产生丁醇。

发明内容

本发明的技术目的在于提供了一种新的产丁醇基因工程菌的构建方法和菌株，使得该构建方法是一种构建含有克氏梭菌丁醇合成途径中关键基因cat1、sucD、4hbd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌ATCC 824中的基因bcd-etfB-etfA、adhE的从丁二酸到丁醇的代谢途径方法，且本发明的菌株能够为产丙酮丁醇大肠杆菌的基因工程研究奠定基础。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案。

一、本发明所述的产丁醇基因工程菌的构建方法。

本发明以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的菌株为出发菌，重组表达基因cat1、sucD、4hbd、cat2、abfd、bcd-etfB-etfA、adhE，获得产丁醇基因工程菌，重组菌株的代谢途径如图1所示。

具体步骤如下：

1）以克氏梭菌基因组DNA为模板，分别纯化扩增出cat1、sucD、4hbd、cat2、abfd基因，插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒pTrcCKL-5；

2）以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出trc-adhE基因后，插入到表达质粒pGEM-T Easy相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A；