[发明专利]产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用

权利要求书

1. 一种产丁醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株为出发菌株，重组表达基因cat1、sucD、4hbd、cat2、abfd、bcd-etfB-etfA、adhE，获得产丁醇基因工程菌。

2. 根据权利要求1所述的产丁醇基因工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

1）以克氏梭菌基因组DNA为模板，分别纯化扩增出cat1、sucD、4hbd、cat2、abfd基因，插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒pTrcCKL-5；

2）以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出trc-adhE基因后，插入到表达质粒pGEM-T Easy相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A；

3）以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出bcd-etfB-etfA基因后，插入到中间重组质粒T-A相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A-B；

4）以中间重组质粒T-A-B为模板，纯化扩增出的trc-adhE-bcd-etfB-etfA基因后，插入中间质粒pTrc99CKL-5相应的酶切位点之间、连接获得最终重组质粒pTrc99e；

5）将构建重组质粒pTrc99e导入缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的出发菌的感受态，获得的阳性转化子即为产丁醇基因工程菌。

3. 采用权利要求1所述的构建方法得到的一株产丁醇基因工程菌菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）LP-99e，其保藏号编号为：CCTCC NO：M 2011403。

4. 权利要求1所述产丁醇基因工程菌的应用，其特征在于：包括菌种活化、种子培养、发酵培养产丁醇三步骤，

（1）菌种活化：划线保藏的产丁醇基因工程菌的菌液到含有氯霉素和氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管；

（2）种子培养：按照体积比1%的接种量接入种子培养基中，有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8-1.0时用0.3mM的IPTG诱导至OD₆₀₀=3；

（3）发酵培养产丁醇：按接种量体积比10%转接至发酵培养基中厌氧发酵；其中，发酵培养基为：LB，葡萄糖15 g/L，卡那霉素30μg/mL，氨苄青霉素50 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，0.3mM IPTG。