[发明专利]一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的一种古老且流行广泛的烈性肠道传染病，曾在世界上引起多次大流行，患者的临床症状多表现为剧烈的呕吐，大量米汤状排泄，会造成迅速脱水；如治疗不及时，可导致低血容量休克、酸中毒等，甚至死亡。

霍乱弧菌由意大利解剖学家Filippo Pacini在1854年首次分离，属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)，需氧或兼性厌氧菌，革兰氏阴性，菌体短小，稍弯曲，呈弧形或逗点状，菌体尾端有鞭毛，运动活泼。霍乱弧菌有多个血清型，其中能够引起霍乱流行的主要有两种：O1群和O139群。自1817年以来，7次全球范围的霍乱大流行均是由O1群霍乱弧菌所引发；1992年印度和孟加拉国首次爆发了非O1群霍乱弧菌引起的霍乱流行，目前已陆续波及亚、美、欧三大洲，构成超越国界、洲界的大流行态势。

鉴于霍乱严重威胁公众的生命安全，因此快速、准确和灵敏地检测霍乱弧菌至关重要。霍乱在我国基本得到有效控制，但发生或流行的潜在威胁依然存在。传统的霍乱弧菌检测方法需要先在碱性蛋白胨培养液中进行菌株培养后取上层培养物做弧菌分离鉴定，该检测方法所需周期长、工作量大，且易受环境、培养条件及主观因素影响，不利于霍乱弧菌的快速诊断。因此建立一种快速、敏感、特异的检测方法对霍乱防治工作具有十分重要的意义。以溶血素基因(hlyA)为探针建立的荧光定量PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的方法，其特异度不高，且能同时检测出非O1群和非O139群霍乱弧菌。

基于SYBR Green的双重荧光PCR方法特异性检测O1群和O139群霍乱弧菌的方法，需借助熔解曲线来区分特异性扩增与非特异性扩增，这使得在待检菌株的目的扩增片段因出现碱基突变而影响产物熔解温度(Tm值)时将很难通过熔解曲线进行判断，在O1群和O139群霍乱弧菌的鉴定应用上有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测的非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法，该非诊断性方法包括：

针对O1群和O139群霍乱弧菌的O抗原合成基因rfb基因设计引物和探针：

进一步，所述探针O1-P和O139-P的5’端所标记荧光素分别为FAM和HEX，探针3’端均连接淬灭基团。

进一步，所述该淬灭基团均为BHQ1非荧光淬灭基团。

进一步，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)用试剂盒提取细菌染色体DNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的20μL PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

进一步，所述O1群和O139群霍乱弧菌标准品制备的具体步骤包括：

1)根据所设计的O1群和O139群霍乱弧菌引物，分别扩增O1群和O139群霍乱弧菌全测序菌株N16961和MO45的纯培养液DNA模板；

2)按照胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段；

3)制备O1群和O139群霍乱弧菌rfb基因克隆子；

4)提取O1群和O139群霍乱弧菌质粒后进行插入片段的限制性酶切分析，取呈阳性的酶切反应结果进行克隆质粒测序实验；

5)O1群和O139群霍乱弧菌质粒DNA的浓度换算为拷贝数后，将质粒稀释成若干个浓度梯度备用。

进一步，所述O1群和O139群霍乱弧菌全测序菌株N16961和MO45的纯培养液DNA模板的扩增条件为：

进一步，所述用胶回收纯化的DNA片段制备O1群和O139群霍乱弧菌rfb基因克隆子，配制的连接反应体系为：