[发明专利]一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法

权利要求书

1.一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

针对O1群和O139群弧霍乱弧菌的O抗原合成基因rfb基因设计引物和探针：

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述探针O1-P和O139-P的5’端所标记荧光素分别为FAM和HEX，探针3’端均连接淬灭基团；所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。

3.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)提取细菌染色体DNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的20μL PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

循环条件：

5.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍乱弧菌标准品制备的具体步骤包括：

1)根据所设计的O1群和O139群弧霍乱弧菌引物，分别扩增O1群和O139群弧霍乱弧菌全测序菌株N16961和MO45的纯培养液DNA模板；

2)按照胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段；

3)制备O1群和O139群弧霍乱弧菌rfb基因克隆子；

4)提取O1群和O139群弧霍乱弧菌质粒后进行插入片段的限制性酶切分析，取呈阳性的酶切反应结果进行克隆质粒测序实验；

5)O1群和O139群弧霍乱弧菌质粒DNA的浓度换算为拷贝数后，将质粒稀释成若干个浓度梯度备用。

6.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍乱弧菌全测序菌株N16961和MO45的纯培养液DNA模板的扩增条件为：

7.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述用胶回收纯化的DNA片段制备O1群和O139群弧霍乱弧菌rfb基因克隆子，配制的连接反应体系为：

8.如权利要求7所述的非诊断性方法，其特征在于，所述O1群和O139群弧霍乱弧菌rfb克隆子制备时，用O1F/O1R和O139F/O139R对涂有Amp100的营养琼脂平板上生长的菌落进行扩增鉴定。

9.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述酶切反应体系如下：

10.如权利要求5所述的非诊断性方法，其特征在于，所述双酶切鉴定呈阳性的克隆质粒上机测序，序列结果与已知目的序列进行比对；所述实时荧光RT-PCR反应的体系中对O1群和O139群弧霍乱弧菌质粒的检测下限均为1.0×10²拷贝/μl。