[发明专利]胞磷胆碱的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞磷胆碱的制备方法，具体涉及发酵法制备胞磷胆碱，属于生物制药技术领域。 

背景技术

胞磷胆碱(CDPC)是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成必须的辅酶。胞磷胆碱临床上广泛用于脑缺血、脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和老年性痴呆等疾病的治疗。胞磷胆碱又名胞二磷胆碱，胞苷二磷酸胆碱。胞磷胆碱已知的制备方法有化学合成法、使用酵母等微生物菌体的酶法、利用基因重组微生物进行转化的酶法等。 

这些制备方法中的共同点是作为原料使用了价格昂贵的胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、胞嘧啶等嘧啶系核苷酸及其前体乳清酸、尿嘧啶等，使得胞磷胆碱的制备成本较高。 

使用酵母等微生物菌体的酶法制造胞磷胆碱，是以胞苷酸和磷酸胆碱作为原料，利用微生物提供反应所需磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。 

此过程中的起始物胞苷酸的价格是非常昂贵的，使得制备成本居高不下。 

CN1074938公开了胞苷二磷酸胆碱的制备方法，该方法是以微生物提供反应所需胞苷三磷酸合成酶、磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。CN1653188公开了胞苷5’-二磷酸胆碱的制备方法，该方法采用胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶在水溶性介质中与生物催化剂接触，蓄积生成CDP-胆碱。CN102199643A公开了一种胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。CN101538598A提供一种胞二磷胆碱的制备方法，其特征是以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱；其中，所述的胞苷一磷酸前体为乳清酸或胞苷；所述的小分子化学效应物质为镁离子、钾离子中的任意一种或两种，与甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一种或几种的组合物。 

以上方法的起始原料乳清酸或尿嘧啶或胞苷酸等价格都比较昂贵，成本也较高。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种以嘧啶从头合成为基础反应的微生物发酵法制备胞磷胆碱的方法。 

发明概述 

本发明的方法不使用嘧啶系核苷酸或其前体如乳清酸、尿嘧啶等价格昂贵的原料，而使用工业上易于得到的、廉价的、可提供胆碱的原料(如氯化胆碱、磷酸胆碱等)经过微生物发酵，制备胞磷胆碱。 

本发明的方法以嘧啶从头合成为基础反应，由简单的起始原料碳、氮源开始，利用一些特定微生物体内合成代谢途径，合成磷酸核糖、氨基酸以及一碳单位与二氧化碳等简单物质，继而合成制备胞磷胆碱的前体胞嘧啶系核苷酸，在含有可提供胆碱的原料如磷酸胆碱或氯化胆碱等的培养液中，由微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下累积生成胞磷胆碱。 

嘧啶核苷酸的从头合成途径的原料是天冬氨酸、谷氨酰胺、CO₂等，这些氨基酸来自生物体内的氨基酸合成代谢。反应过程中的关键酶在不同生物体内有所不同，在细菌中，嘧啶核苷酸的生物合成，受到终产物反馈控制的点有三个：合成途径的第一个调节酶是氨基甲酰磷酸合成酶，它受尿嘧啶核苷酸(UMP)的反馈抑制；另两个调节酶是天冬氨酸氨甲酰转移酶和胞苷三磷酸(CTP)合成酶，它们都受胞苷三磷酸(CTP)的反馈抑制。前者被抑制将影响尿苷酸和胞苷酸的合成，后者被抑制只影响胞苷酸的合成。 

很多微生物发酵能够产生胞嘧啶系核苷酸，如果解除UMP、CTP的反馈抑制作用，截止嘧啶合成途径中的起始氨基酸天冬氨酸的分支代谢途径，并选择产胞嘧啶系核苷酸活跃时期的菌体或培养物作为产胞嘧啶系核苷酸的酶源，能够较快速的代谢生成胞嘧啶系核苷酸，在该微生物或其它微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下，累积生成胞磷胆碱。从而避免使用价格昂贵的嘧啶系核苷酸为前体物，进一步降低制备成本。 

本发明以此为出发点，选择了适宜该方法的菌株，通过微生物发酵制备胞磷胆碱。 

发明详述 

本发明的技术方案如下： 

一种胞磷胆碱的制备方法，以嘧啶从头合成为基础反应，该方法包括：在有微生物A的培养液存在的情况下，或者还有微生物B的培养液或处理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20～38℃反应10～72小时，控制pH 5～7.5，累积生成胞磷胆碱。