[发明专利]一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，涉及核酸的检测试剂及其在肿瘤诊断分型和预后中的应用，尤其是一种检测p52^Shc/p66^Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用。

背景技术

近年来恶性肿瘤患者人数逐渐增加，已成为临床上导致患者死亡的主要因素之一。肿瘤标志物(Tumor Marker TM)在肿瘤普查、诊断、判断预后、评价治疗疗效和高危人群随访等方面都具有较大的实用价值，是目前肿瘤学研究的关键问题之一。目前已经应用于临床的肿瘤标志物有甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等多种，但总体来说还是不够完善，临床仍然迫切要求更多更好的肿瘤标志物和检测试剂盒的发现/发明和临床应用。

最新研究表明，肿瘤转移抑制基因p66^Shc的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，在正常体细胞中p66^Shc稳定表达，而在肿瘤细胞中p66^Shc表达失活，导致细胞绕过失巢凋亡途径，促进肿瘤的转移。小鼠实验证明，p66^Shc是人体内一个重要的肿瘤转移抑制基因，该基因的表达失活大大促进了肿瘤的转移。因此，p66^Shc的表达水平可以成为一个潜在的、具有临床应用前景的肿瘤标志物。发明内容

本发明的目的在于提供一种检测p52^Shc/p66^Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用，本试剂盒具有灵敏度高、成本低、检测方法简便、快速的优点。

本发明的目的是这样实现的：

一种检测p52^Shc/p66^Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒，试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成，其中PCR反应体系含有特异扩增p52^Shc基因的引物的序列为：序列1和序列2；含有特异扩增p66^Shc基因的引物的序列为：序列3和序列4。

而且，所述RNA抽提体系具体包括：TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和Nuclease-Free Water。

而且，所述RNA逆转录反应体系具体包括：oligo(dT)₁₈、dNTP Mix、5×Reverse Transcript Reaction Buffer、Nuclease-Free Water和Reverse Transcriptase。

而且，所述PCR反应体系具体包括：Nuclease-Free Water、dNTP Mix、10×PCR Reaction Buffer、DNA聚合酶、引物序列1、引物序列2、引物序列3和引物序列4。

一种检测p52^Shc/p66^Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤如下：

(1)从临床获得实体肿瘤患者手术后的新鲜肿瘤样本，用RNA抽提体系提取样本的总RNA；

(2)使用RNA逆转录反应体系将该总RNA经逆转录反应转变为cDNA；

(3)以该cDNA为模板，用PCR反应体系通过PCR反应分别特异扩增p52^Shc和p66^Shc基因的目标DNA片段，将PCR产物送到生物技术公司测序；

(4)分析该PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图，计算p66^Shc单等位基因表达模式的丢失程度，对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。

而且，所述步骤(4)将p52^Shc基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为x1和y1；将p66^Shc基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为x2和y2；根据下列公式计算p66^Shc单等位基因表达模式丢失程度值LOM，根据表1判断患者的病理分期和预后，公式为：