[发明专利]一种喹乙醇代谢物半抗原制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种喹乙醇代谢物半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox)，又名：快育灵、倍育诺(Bayonox)、奥拉金、喹酸胺醇、Fedan。分子式：C₁₂H₁₃N₃O₄。是1965年由德国Bayer公司由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的淡黄色结晶性粉末，微溶于水。

因其具有良好的广谱抗菌效果尤其是对大肠杆菌、沙门氏杆菌等革兰氏阴性致病菌所致的消化道疾病具有良好的治疗效果，并且有促进畜禽对饲料的消化利用，提高生长速度等作用而被广泛应用于饲料及饲料添加剂中。近年来在水产饲料中，喹乙醇曾一度被称为“水产瘦肉精”，经历了从被忽略毒副作用到被客观评价的过程。喹乙醇的毒性随动物种属不同存在较大差异，特别对禽和鱼类，有中度至明显蓄积毒性和一定遗传毒性，对部分鱼类有明显致畸作用。

喹乙醇的蓄积毒性不但能使动物发生中毒或死亡，且其可能残留在畜产品中，对人体也有较大危害。因此，使用时，必须严格按其使用范围、剂量浓度实行休药期。鉴于喹乙醇的毒性和存在的潜在危害，因而人们重新对喹乙醇的安全性进行评价，对喹乙醇的使用也做出了新的规定。美国没有批准使用；欧盟也从1999年开起始全面禁止使用喹乙醇；我国对喹乙醇使用的限制也更加严格。我国农业部颁布的《动物性食品兽药最高残留限量》中也列入了喹乙醇。国家进出口检验检疫局制定了肉中喹乙醇残留量的检验方法《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口肉中喹乙醇代谢物残留量检验方法SN 0197-93》也把鸡饲料、饮水及鱼饲料中的喹乙醇作为违禁药物进行监督检验。

由于动物在摄食喹乙醇后，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是最后离开动物机体的代谢物，也是喹乙醇的标示残留物，所以在监控喹乙醇残留时通常要分析其代谢产物MQCA的含量。

目前的喹乙醇检测方法多为色谱法，但是需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工抗原及抗体的制备。因为喹乙醇代谢物是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、方便、准确的检测动物组织中的喹乙醇代谢物残留，可为建立监控动物源性食品中喹乙醇残留提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种喹乙醇代谢物半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。本发明提供的喹乙醇代谢物半抗原，是式(1)所示化产物：

式1

所述喹乙醇代谢物半抗原的合成路线示意图见图1。

本发明还公开了式(1)所示产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取0.38g喹乙醇代谢物(MQCA)，0.20g氨基丁酸及少量4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入20mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF)；

(2)0℃条件下缓慢滴加0.8g二环己基碳二亚胺(DCC)于5mL干燥的DMF混合液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应40h；

(3)蒸除溶剂，柱层析纯化后得到MQCA与氨基丁酸的缩合物，即为式(1)所示产物。本发明提供的喹乙醇代谢物抗原，是将式(1)所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

所述喹乙醇代谢物抗原的结构示意图见图3。

本发明还公开了所述喹乙醇代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤：

方法一：

(1)将30mg喹乙醇半抗原，充分溶解于1mL DMF中；

(2)称取载体蛋白50mg，使之充分溶解在3mL PBS(pH 7.2)中，将喹乙醇半抗原溶解液逐滴缓慢滴加到该载体蛋白溶液中得溶液A；

(3)称取12.5mg EDC，用1mL水溶解后缓慢于室温下加入A中，搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

方法二：

(1)将20mg喹乙醇半抗原用1.0mL DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯15μL，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A。