[发明专利]牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶免疫印迹技术，具体是一种牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

早期对于食物过敏的检测，主要集中在病史观察，及体内试验（如皮肤点刺试验、食物激发试验）；但这些方法不仅昂贵、耗时，并且存在着诱发严重过敏反应的风险，已渐渐被淘汰。过敏反应的本质是一种错误的免疫应答，机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体（IgE和IgG），而正常机体内不存在此种特异性抗体。因此，目前临床上常采用检测特异性抗体来确定患者食物过敏情况，最终确定过敏食物。

采用体外检测特异性抗体的方法来确定食物过敏原，显著优于普遍使用的皮肤点刺试验（体内检测），它具有不受药物干扰、安全无风险、患者容易接受等优点。特异性IgE测定基于免疫化学原理，即通过已知抗原（过敏原）测定未知抗体（IgE）。血清特异性IgE需要采用标记免疫技术，通常使用酶、荧光物质等作为标记物，即酶联免疫吸附试验、酶免疫印迹法以及荧光酶免疫法。因此，特异性IgE抗体被广泛用于过敏患者食物过敏原的鉴别。

特异性IgE测定原理是用已知抗原（过敏原）检测未知抗体（sIgE）,包被于固相材料（聚苯乙烯或硝酸纤维素膜）表面已知抗原的组份将决定特异性IgE检测结果的准确性。然而，现有诊断试剂盒多采用从食物中提取的总蛋白成份作为已知抗原，一般不进行单一成份提取，也不考虑各组份之间的比例关系。基于食物总蛋白提取物作为包被抗原，检测特异性IgE的食物过敏原诊断试剂盒均存在如下缺陷或不足。以牛奶为例：①牛奶中过敏原组份蛋白浓度比例不同，而含量低的蛋白成份未必不是主要过敏原。如酪蛋白含量在牛奶中约占80%，但并不是主要过敏原；而β-乳球蛋白含量在牛奶中只占10%，但却是重要的过敏原。如用牛奶中提取的总蛋白作为包被抗原，酪蛋白包被浓度偏高，β-乳球蛋白包被浓度偏低。为此，不能很好地检测针对β-乳球蛋白的特异性IgE。②食物过敏反应存在明显个体差异，不同牛奶过敏患者血清中特异性IgE存在明显个体差异；换言之，牛奶过敏患者血清中特异性IgE的种类和浓度存在一定差别，而这种差别对临床诊断和治疗有重要指导意义。现有食物过敏原试剂盒由于采用总蛋白进行包被，不能对特异性IgE的异质性进行区分。

发明内容

本发明为了解决目前牛奶特异性诊断试剂盒只能筛选出血清中牛奶特异性IgE的存在，而不能确定患者对牛奶中不同过敏蛋白过敏性的差异，以及由于不同过敏原组份包被浓度差异导致造成的假阴性或假阳性的问题，而提供一种多组分特异性IgE联合测定的牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种牛奶抗体谱诊断试剂盒，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括分别包被有酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和兔抗鼠IgG抗体的硝酸纤维膜检测条，标本稀释液，酶标抗体稀释液和浓缩洗液。

所述牛奶抗体谱诊断试剂盒，其硝酸纤维膜检测条上按一定间距形成有包被酪蛋白并标记T1、包被大分子蛋白并标记T2、包被α-乳白蛋白并标记T3、包被β-乳球蛋白并标记T4的检测区，以及包被兔抗鼠IgG抗体并标记C的质控区。

一种牛奶抗体谱诊断试剂盒的制备方法，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括包被有酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的检测区和包被兔抗鼠IgG抗体的质控区的硝酸纤维膜检测条，稀释待测血清的标本稀释液，与兔抗鼠IgG抗体结合的酶标抗体稀释液和浓缩洗液；

其中，硝酸纤维膜检测条的制备方法是：硝酸纤维素膜在膜处理液（TBS）中浸泡5-10分钟，经蛋白点样板按一定间距，以1.6-2.4毫克/毫升的浓度分别一次点样形成包被酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的检测区和包被兔抗鼠IgG抗体的质控区，室温温育2小时，依次用蒸馏水、膜处理液冲洗后，再用1.8%-2.2%的聚乙烯醇溶液室温封闭1小时，漂洗  弃去封闭液，风干，备用。

其大分子蛋白的制备方法是：

a.鲜牛奶低温离心去脂过滤得脱脂奶，加入等量0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液,用盐酸调pH至4.6；40℃水浴30min，使酪蛋白充分析出，离心取上清的乳清蛋白，超滤器浓缩，使蛋白浓度至5-10mg/ml，备用；

b.另取凝胶粉末溶于足量双蒸水中充分溶胀，溶胀后的凝胶经脱气处理，装入层析柱内，用0.01M pH 7.4 PB充分平衡；

c.取2-3ml乳清蛋白溶液，加在凝胶上面，用0.01M pH 7.4 PB洗脱，最先被洗脱的蛋白峰即为大分子蛋白。