[发明专利]用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒多重PCR方法的引物，属于病毒的检测领域。 

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)和犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)是引起犬发病的主要病原，这3种病毒单一或混感后临床致死率可达50％-100％，给养犬业造成巨大经济损失。 

临床上，CDV引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型四种，CPV主要引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。CAV根据其血凝和中和试验等特性不同可将CAV分为1型和2型，即CAV-I和CAV-II。。CAV-I在临床上可导致犬传染性肝炎、狐狸和熊脑炎的发生。CAV-II引起犬、狐传染性喉气管炎。 

犬的这几种主要疾病临床症状相似，并常有混合感染，给诊断造成困难。常用的单项PCR方法耗时长，有必要建立快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。鉴于此，本试验建立了CDV、CPV、CAV-I和CAV-II的多重PCR检测方法，为临床检测提供保障 

发明内容

本发明所要解决的结束问题是克服现有技术的不足，提供一套可用于检测犬瘟热病毒野毒株的RT-LAMP引物。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 

本发明的一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括三对引物，其中，所述的用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述的用于犬细小病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述的用于I型 和II型犬腺病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 

本发明还提供了一种检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、I型和II型犬腺病毒(CAV-I、CAV-II)的方法，其特征在于包括以下步骤： 

配制25μL PCR反应体系：10X Ex Buffer 2.5μL、dNTPs 2μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25μL、CDV-N1和CDV-N2各0.35μL、CPV-NS1和CPV-NS2各0.35μL、CAV-E31和CAV-E32各0.65μL、CDV模板0.75μL、CPV模板0.75μL、CAV-I模板0.75μL、CAV-II模板1.5μL、灭菌ddH₂O 13.5μL； 

其中，引物CDV-N1和CDV-N2用于犬瘟热病毒的检测，其序列分别为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示；引物CPV-NS1和CPV-NS2用于犬细小病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示； 

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min； 

观察：取5μL PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。 

进一步的，本发明还提供了一种用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物。 

更进一步的，本发明还提供了所述的引物在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。及 

所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。 

以本发明所设计的引物采用多重PCR检测方法对CDV、CPV、CAV-I和CAV-II进行检测，检测结果均为阳性，而对其他常见犬源性病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用多重PCR方法，可以同时检测CDV、CPV、CAV-I和CAV-II，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本发明所设计的引物序列在发病犬早期检测和快速诊断中具有重要意义。 

附图说明

图1为多重PCR扩增结果；