[发明专利]一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌，人一旦食用被该菌污染的水产品，易引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠道症状。因此，对副溶血性弧菌的检测是水产品安全检测的重要内容，如在进出口水产品检测的项目，在饮用水、食品检测和食品中毒源、传染病源调查等工作中，都需对该菌进行检测。副溶血性弧菌的传统检测需经过增菌、选择性培养、生理生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源。近年来随着生物技术的发展，PCR、DNA探针、ELISA等相关技术已应用于副溶血性弧菌的检测，但是食品样品和临床样品中的复杂组分往往会干扰副溶血性弧菌检测的准确性；且在低污染水平下，通常需要经过增菌培养以达到检测限，因此检测时间也大大的延长。

免疫磁分离(Immonumagnetic Separation，IMS)技术是一种对细胞和微生物进行分离和富集捕获的免疫学方法。它具备快速富集捕获目的靶标和减少其它杂质干扰的优势。免疫磁珠由载体微球和免疫配基通过共价基团偶联而成。目标菌体细胞表面抗原与连有磁珠的抗体结合形成菌体细胞和免疫磁珠复合物，该复合物在磁场作用下会发生定向移动，聚集在磁场周围，从而与其它物质分离。IMS可以有效的分离目的细胞，并能够有效的去除食品样品或临床样品中的抑制因子，是有效的样品前处理方法。该技术和PCR，ELISA等技术连用能够有效的提高检出率和灵敏度。目前，利用IMS对目的细菌的分离多采用人工操作的方法进行，操作过程繁琐，容易污染样品，反应耗时长，单个样品的处理量有限，且不能实现样品的批量处理。

系统是由英国Matrix公司根据免疫磁富集的原理研发设计，可进行高通量细胞分选和免疫富集的仪器。它由两部分构成，一次性反应套装和反应支架；反应套装包括反应管和洗脱管，通过无菌管路连接，安装在反应支架上，在磁场的作用下，经过富集和洗脱，将磁珠和菌体细胞的复合物聚集，从而完成免疫富集。该系统完全自动化操作，16min内完成IMS，单个样品的处理量可达25-50ml，并可同时处理5个样品，可实现高通量处理样品，且较好地避免了人工操作IMS引起的资源损耗和样品污染等问题。目前，采用进行免疫富集的报道仅有甲型肝炎病毒HAV(Efstathia et al，2008)、沙门氏菌(Warren BR et al，2007)、大肠杆菌O157:H7(Willis et al，2011)。借助系统对副溶血性弧菌高通量富集捕获的相关研究尚未见报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是在于：提供一种免疫磁珠，该免疫磁珠适用于系统高通量富集捕获副溶血性弧菌。

这种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用系统进行免疫富集。

免疫磁珠的制备方法：

磁珠活化：用2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH 5)洗涤磁珠1-3次，然后加入50mg/ml的碳二亚胺溶液和50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应20-40分钟，得到活化的磁珠；

磁珠与多抗偶联：将副溶血弧菌多抗加入到活化的磁珠中，室温培养2-4小时；加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS溶液，封闭反应20-40分钟；加入以含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3、0.1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，配成终浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液。

本发明中还需要解决的技术问题是提供一套适用于系统运行的方案，用于对副溶血性弧菌高通量富集捕获。

解决上述技术问题的方案为：

应用系统高通量富集捕获副溶血性弧菌的方法，其反应步骤如下：

(1)取浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液不少于50μl于PBS洗涤缓冲液中反复洗涤1-3次，再加入100μl PBS重悬免疫磁珠。

(2)安装反应套装：将50ml反应液和如步骤(1)所述100μl免疫磁珠置于样品管，在洗脱管中加入35ml的洗脱液。