[发明专利]小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种外源染色体的切割鉴定方法，具体的说是一种小麦-中间偃麦草异代换系中外源染色体的微分离方法，属于分子细胞遗传学领域。

背景技术

染色体微切割、微分离与微克隆(chromosome microdissection and microcloning)技术是在1981年由Scalenghe创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了80个克隆，随后用于鼠和人类染色体的切割。随着PCR技术的发展，微切割和微克隆技术得到了较大发展，利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物染色体文库的构建、特异探针筛选、抗性基因的克隆以及遗传与进化研究上得到了较为广泛应用，但是，相比较而言，植物在这方面开展的研究仍然滞后于动物和人类。目前，植物染色体显微切割技术主要存在以下几个方面的困难：

（1）植物细胞壁的存在、同步化的困难，阻碍了良好分散染色体标本的制备，影响了切割效率。

（2）植物基因组倍性多样，染色体结构变异大，基因排列顺序不够保守；植物染色体DNA含量高、蛋白质含量低，大多数染色体上不显示G、R或Q带带纹，从而影响DNA序列，通行的C带，对染色体DNA破坏太大，不利于构建完整的DNA文库；而有些植物染色体大小差异不明显，带纹相似，难于精确识别染色体及其细微结构，加大了分析的复杂性。

（3）植物染色体DNA高度重复序列多，如中间偃麦草、大麦、黑麦和燕麦核基因组有约80%的重复序列，麦类作物DNA含量高，如六倍体燕麦DNA含量为13.2—14.3pg，中间偃麦草C值为1.7×10⁹bp，平均每条染色体0.8×10⁹bp，相当于人类基因组的四分之一若每个插入片段为1kb，每条染色体特异性DNA文库包含8×10⁵以上克隆，筛库工作量巨大。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供基于SLμCELLCUT系统的小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，标本的制备方法简单，其鉴定方法简单，分析简单，便于染色体的切割与回收，为后续切割染色体的鉴定与分析奠定基础。

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：小偃麦异代换系中外源染色体的微分离技术，包括以下步骤：

步骤一、小麦根尖细胞染色体标本的制备

1）按重量份数比取0.5份的中国春小麦种子和0.5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为1—4℃条件下，放置24小时，后在温度为25℃条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为1.5—2.0cm时，取0.5—0.8cm的根尖部位，备用；

2）取步骤1）中的小麦根尖放在0℃的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2—3份的温度为1—4℃的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将小麦根尖放于质量浓度为70%的酒精中，备用；

3）试剂的配制：

①混合酶液：按重量份数比取1份质量浓度为2％的纤维素酶和1份质量浓度为2％的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；

②石炭酸品红溶液：取3g的碱性品红和100ml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；

取10ml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；

取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；

取10—20ml的原液c、80—90ml质量浓度为45%的乙酸和1.8g的山梨醇，混合均匀，制得石炭酸品红溶液，备用；