[发明专利]小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法

权利要求书

1.小偃麦异代换系中外源染色体的微分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、小麦根尖细胞染色体标本的制备

1）按重量份数比取0.5份的中国春小麦种子和0.5份的山农小麦种子，混合均匀，后将混合后的小麦种子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麦种子，在温度为1—4℃条件下，放置24小时，后在温度为25℃条件下培养使小麦种子发芽，继续培养至新生小麦根长为1.5—2.0cm时，取0.5—0.8cm的根尖部位，备用；

2）取步骤1）中的小麦根尖放在0℃的冰水混合物中，放置24小时后取出小麦根尖放于2—3份的温度为1—4℃的卡诺氏液中，放置24小时，取出，将小麦根尖放于质量浓度为70%的酒精中，备用；

3）试剂的配制：

①混合酶液：按重量份数比取1份质量浓度为2％的纤维素酶和1份质量浓度为2％的果胶酶，混合均匀，制得混合酶液；

②石炭酸品红溶液：取3g的碱性品红和100ml质量浓度为70%的乙醇，混合均匀，形成原液a，备用；

取10ml原液a和90ml质量浓度为5%的石炭酸水溶液，混合均匀，形成原液b，备用；

取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml质量浓度为37%的福尔马林，混合均匀，形成原液c，备用；

取10—20ml的原液c、80—90ml质量浓度为45%的乙酸和1.8g的山梨醇，混合均匀，制得石炭酸品红溶液，备用；

4）将步骤2）中的小麦根尖从酒精中取出，将1g的小麦根尖浸泡在10ml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的小麦根尖，将浸泡后的小麦根尖放在电子显微镜的载物台上，进行初步镜检，得到有丝分裂中期的根尖细胞染色体，后将有丝分裂中期的根尖细胞染色体加到1ml步骤3）中得到的混合酶液中，在温度为37℃条件下，酶解1—1.5小时，形成酶解物Ⅰ，利用无菌蒸馏水对酶解物Ⅰ冲洗10分钟，在0.5ml的离心管a内加入50μg的酶解物Ⅰ和50μl步骤3）中得到的石炭酸品红溶液，混合均匀，形成混合物，将混合物涂在载玻片上，在含有混合物的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使混合物附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成混合物痕迹，利用质量浓度为75%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为：将质量浓度为75%的酒精滴加在含有混合物痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗1分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的混合物痕迹进行第二次细胞内脱水，制得小麦根尖细胞染色体标本；

步骤二、花粉母细胞染色体标本的制备

1）取处于减数分裂中期I的小麦-中间偃麦草异代换系山农0095与小麦品种烟农15的杂种F₁代花粉母细胞，备用；

2）按重量份数比取1份步骤1）中得到的花粉母细胞和2—3份的卡诺氏液，将花粉母细胞放于1—4℃的卡诺氏液中，放置3—24小时，取出，将花粉母细胞放在质量浓度为70%的酒精中，备用；

3）将步骤2）中的花粉母细胞从质量浓度为70%的酒精中取出，将1g的花粉母细胞浸泡在10ml的蒸馏水中，放置10分钟，过滤，得到浸泡后的花粉母细胞，将浸泡后的花粉母细胞加到1ml步骤一）中得到的混合酶液中，在温度为37℃条件下，酶解1小时，形成酶解物Ⅱ，利用无菌蒸馏水对酶解物Ⅱ冲洗10分钟，将酶解物Ⅱ涂在载玻片上，在含有酶解物Ⅱ的载玻片上覆盖一层分离膜，压紧分离膜和载玻片，使酶解物Ⅱ附着在分离膜上，后将分离膜与载玻片分离，在分离膜的表面上形成酶解物Ⅱ痕迹，利用质量浓度为70%的酒精对分离膜上的酶解物Ⅱ痕迹进行第一次细胞内脱水，脱水步骤为：将质量浓度为70%的酒精滴加在含有酶解物Ⅱ痕迹的分离膜上，放置3分钟，后利用蒸馏水对分离膜冲洗1分钟，晾干，然后依据第一次细胞内脱水的方法，利用质量浓度为100%的酒精对分离膜上的酶解物Ⅱ痕迹进行第二次细胞内脱水，制得花粉母细胞染色体标本，备用；

步骤三、小麦根尖细胞染色体的显微分离

在步骤一中制得的小麦根尖细胞染色体标本的载玻片上滴加20μl无水乙醇，后在载玻片上覆盖盖玻片，将载玻片置于SLμCELLCUT显微切割系统的载物台上，在4×物镜下找到目标染色体，然后转换至40×物镜下，对染色体的单价体进行切割，收集切割后的单根尖细胞染色体存放在1.5ml离心管a中，备用；

步骤四、花粉母细胞染色体的显微切割

依据步骤三的操作方法对花粉母细胞染色体的显微切割，将切割收集后的花粉母细胞染色体存放在1.5ml离心管b中，备用；

步骤五、对切割后的小麦根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体分别进行DOP-PCR扩增

1）试剂配制及兼并引物序列的合成：

蛋白酶K处理液：在500μl的1×Taq DNA聚合酶缓冲液中加入0.3mg的蛋白酶K，混合均匀，形成质量浓度为600ng/μl的蛋白酶K母液，后用1×Taq DNA聚合酶缓冲液稀释成质量浓度为20ng/μl的蛋白酶K处理液，备用；

兼并引物序列：5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’；

2）小麦根尖细胞染色体的预处理

将步骤二中得到的小麦根尖染色体放在0.5ml离心管b内，后在含有小麦根尖染色体的0.5ml离心管b内加入20μl步骤1）中得到的质量浓度为20ng/μl的蛋白酶K处理液，混合均匀，形成混合液，将含有混合液的0.5ml离心管b置于37℃条件下，放置4小时，然后将0.5ml离心管b放于离心机内，以转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到上层液体，将上层液体放在70℃条件下，灭菌20分钟，取出，得到处理后的小麦根尖目标染色体，备用；

3）花粉母细胞染色体的预处理

依据步骤2）中对小麦根尖细胞染色体的预处理方法对花粉母细胞染色体进行预处理，得到花粉母细胞目标染色体，备用；

4）小麦根尖目标染色体的DOP-PCR扩增

第一次PCR扩增：

PCR反应体系Ⅰ：在0.5ml离心管c中加入24.6μl的处理后小麦根尖目标染色体、4μl的10×PCR缓冲液，3μl质量浓度为25mmol/L的Mg²⁺、4μl浓度为25mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、0.4μl质量浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶、2μl的兼并引物和12μl的去离子水，形成反应体系Ⅰ，备用；

PCR程序：将反应体系Ⅰ放入PCR仪内，94℃预变性10分钟，94℃变性1.5分钟、50℃退火1.5分钟、72℃延伸3分钟，PCR扩增共5个循环，然后94℃变性1.5分钟、57℃退火1.5分钟、72℃延伸1.5分钟，PCR扩增共25个循环，72℃再次延伸10分钟，形成PCR产物Ⅰ，备用；

第二次PCR扩增：

将PCR反应体系Ⅰ配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为PCR产物Ⅰ，按照相同方法配制成PCR体系Ⅱ，后依据第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行第二次PCR扩增，得到PCR产物Ⅱ，备用；

5）花粉母细胞目标染色体的DOP-PCR扩增

第一次PCR扩增：

将步骤4）中PCR反应体系Ⅰ配制过程中的处理后小麦根尖目标染色体替换为处理后的花粉母细胞目标染色体，按照相同方法配制成PCR反应体系Ⅲ，后依据步骤4）中第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增，得到PCR产物Ⅲ，备用；

第二次PCR扩增：

将PCR反应体系Ⅲ配制过程中的处理后的花粉母细胞目标染色体替换为PCR产物Ⅲ，按照相同方法配制成PCR体系Ⅳ，后依据花粉母细胞目标染色体的第一次PCR扩增中PCR程序的方法进行花粉母细胞目标染色体的第二次PCR扩增，得到PCR产物Ⅳ，备用；

步骤六、利用聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测PCR产物Ⅱ和PCR产物Ⅱ，在凝胶成像系统中确认PCR产物Ⅱ中含有切割后的普通小麦染色体的目的基因，在凝胶成像系统中确认PCR产物Ⅳ中含有切割后的中间偃麦草外源染色体的目的基因。