[发明专利]纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒。

背景技术

鱼虾蟹贝和两栖爬行动物的病毒性疫病是严重威胁水生动物养殖业健康发展和物种多样性和环境生态安全的关键因素。如何能够高效能的从水生动物生活水体中吸附富集染疫水生动物排放到生活水体中的病毒颗粒用于实验室的疫病病原微生物检测，是一项非常有意义的工作。

目前，水生动物疫病检测标准中规定的样品采集方法一般都是针对活体动物或濒死动物的组织脏器进行采样，然后研磨组织样品以后进行病毒的分离培养和病毒鉴定。

如鲤春病，一般病鱼的初步诊断是根据病鱼外表特征与临床症状作出初步判断。春季水温低于20℃时，养殖鲤易出现典型的SVC症状。有时鱼类大规模死亡时并无明显外表症状，需通过解剖观察内部器官典型症状。病料宜采集肝、肾、脾和脑。血液、脑病毒滴度不高，但持续时间最长，而鳃、血液和肠病料存在干扰物。OIE建议，幼鱼宜采集肾和脑病料为佳，较大鱼应采集肝肾、脾和脑组织为佳。实验室确诊可用EPC等敏感细胞培养分离病毒，然后采用病毒中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR等方法鉴定。上述方法可用于发病鱼或无症状染疫鱼检测。也可以采用免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR等方法直接检测病料中的病原，但确诊须通过培养法分离病毒，以防假阳性。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法。该方法可以有效富集水生动物，例如鱼类、两栖类、爬行类动物生活水体中的水病毒（如鱼类和蛙病毒属病毒），并能预扩增和保持富集的水病毒的活性，适用于渔场和野外水域中水病毒的监测和检测采样。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将纳米富集材料加入到20L~30L水生动物生活水体中富集水病毒； 

（2）对步骤（1）的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；

（3）将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；

（4）将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；

（5）加入磁铁，混匀后静置，使纳米磁珠吸在磁铁上；

（6）取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中，病毒释放在保存液中，并在相应的敏感鱼类细胞系内进行预扩增。

其中，所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体中水病毒的纳米富集材料Ⅰ，该纳米富集材料Ⅰ是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；或用于富集水生动物海水生活水体中水病毒的纳米富集材料Ⅱ，该纳米富集材料Ⅱ是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；

所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe₃O₄纳米磁珠；

所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，例如199细胞培养液、MEM细胞培养液、L15细胞培养液等；并且在细胞培养液中添加了相应的敏感鱼类细胞，青霉素（100U/ML）、链霉素（0.1mg/ML）和制霉菌素（25U/ML），并且调最终细胞培养液的pH为7.5~8.5。

所述鱼类细胞为CO（Ovary of grass carp  草鱼性腺细胞），EPC（Epithelioma Papulosum Cyprini鲤鱼上皮瘤细胞），FHM（fathead minnow 胖头鱼肌肉细胞），CLC (Carp leucocytes cell鲤鱼白血球细胞)，CIK(kidney of grass carp 草鱼肾脏细胞)，CHSE  （chinook salmon embryo大菱大马哈鱼胚胎细胞），CCO（Channel catfish ovary 鲶鱼性腺细胞），BF-2（Bluegill fry  蓝太阳鱼鳃细胞），R1（liver of rainbow trout  虹鳟鱼肝细胞），RTG-2  （rainbow trout gonad 虹鳟鱼性腺细胞）中的一种或几种。根据目的要富集和预繁殖的病毒种类选择相应的敏感细胞系。

进一步地，步骤（1）中，富集水病毒的具体方法为将10g~50g纳米富集材料加入到20L~30L水生动物生活水体中，搅拌3min使之混匀，然后静置0.5h~24h。