[发明专利]一种眼斑拟石首鱼的抗虫肽及其基因克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋动物抗虫肽及基因克隆方法，尤其是涉及一种眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin及其基因克隆方法和应用。

背景技术

刺激隐核虫是目前严重威胁海洋鱼类的一种传播性极强的寄生虫，已被列为农业部2008年12月11日发布的新版《一、二、三类动物疫病病种名录》(农博，2009。农业部发布《一、二、三类动物疫病病种名录》，渔业致富指南6：6)中的二类动物疫病，它所引发的“白点病”和继发性细菌性感染给我国海水鱼类养殖带来了巨大的损失。尤其以大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、石斑鱼(Epinephelussp.)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)等“白点病”危害最为严重，每年都带来了数亿元的经济损失，寄生虫的防治是目前鱼类养殖急需解决的重大难题。

目前，防治海水鱼类“白点病”的方法十分有限，化学杀虫药物的长期使用可使海洋污染加剧和海洋鱼类健康严重受损，这已成为“白点病”问题年趋恶化的重要因素之一，探索健康安全的新型防控方式是水产业迫切需要的产业技术需求。

海洋动物自身存在着宿主防御肽(Host Defense Peptide，HDP)以应对鱼类自身面临的疾病威胁，其中海洋动物自身的抗虫活性物质为解决海水养殖鱼类自身的寄生虫难题提供了重要启示。2008年，国外首次报道杂交斑纹鲈(hybrid striped bass)的抗菌肽piscidin(源自英文单词Piscine，意为鱼的)具有较强的抗外寄生虫的作用。我国也发现蓝子鱼(Siganus ConcatenaluJ)的血清(王方华，2010。黄斑蓝子鱼血清抗寄生虫及细菌活性物质的研究，中山大学博士学位论文)中存在着抗虫活性物质。从丰富的海洋动物抗虫活性物质资源库中筛选具有特殊杀虫效果的抗虫肽，进行抗虫相关产品开发或者提高鱼类自身抗虫水平，具有巨大的科学价值、市场需求和发展前景。

鱼类piscidin是一类非常重要的抗菌肽，对细菌、真菌、寄生虫同时具有抗性，因此，它作为重要的抗虫肽资源，对于解决刺激隐核虫重大产业技术难题具有潜在价值和重要意义。在利用基因工程技术制备生产过程中，抗虫肽piscidin是否具有外源基因毒性，是决定能否低成本生产制备的技术关键之一。因为毒性基因可能对工程菌株(大肠杆菌或酵母菌)自身造成毒性，使产率偏低，成本大幅上升。我国尚未有海洋动物抗虫肽的相关公开报道。

发明内容

本发明的第一目的是针对现有存在的严重危害海洋鱼类的刺激隐核虫病，提供既能有效杀灭刺激隐核虫，对环境不会造成不良影响，又能容易借助基因工程技术生产制备抗虫肽产品的眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列的核苷酸序列。

本发明的第二目的在于提供眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin的氨基酸序列。

本发明的第三目的在于提供眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列的克隆方法。

本发明的第四目的在于提供眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin在制备防治刺激隐核虫病药物中的应用。

所述眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列，其核苷酸序列记为序列1，所述序列1为：

ttctcttact gagaatacag tctacagtct acagactatc catcagtgaa aggatgaagt     60

gtactgcggt ctttcttgtg ttgttcatgg tcgttctcat ggctgaacct ggagagtgta    120

tctggggact gatcgcccat ggagtcgcgc atgttggttc gttgatccat gggcttgtca    180

atgggaacca tggcgggaac caggcggagg agcagcagga gcagctcaac aaacgttcac    240

tttcttatga ccacccgtag gagcttcaac ggcgagactg aagatgaagc aacgtcagaa    300

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