[发明专利]一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种去除植物叶片Rubisco酶干扰，富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法，更特别的是涉及一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法。

背景技术

西瓜是我国重要的经济作物之一，也是世界性重要的水果型蔬菜，研究其抗逆性机理和营养品质功能因子对于西瓜的栽培和生产尤其重要。西瓜叶片蛋白质组学研究能够为西瓜的抗逆性栽培和营养品质分析提供重要的功能信息。蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究分离蛋白质最常用的技术手段。然而，西瓜叶片中大约有50％的可溶性蛋白质为核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carbox-ylase/oxygenase，Rubisco)，导致西瓜叶片中其他低丰度蛋白质提取不完全或者遮挡和限制了低丰度蛋白质进入二维凝胶和低丰度蛋白质在凝胶上的显现，使得西瓜叶片蛋白质组学研究的质谱鉴定结果大多为Rubisco的大小亚基，妨碍了其他低丰度蛋白质的分离和鉴定，尤其是一些调控因子和信号因子很难或不能被双向电泳分离到，成为困扰西瓜叶片蛋白质组研究的难题。

目前，去除叶片Rubisco酶干扰的方法主要有以下四种：1)Rubisco免疫耗竭柱(Immunodepletion columns)(Cellar et al.，2008)和抗体亲和的方法(Hashimoto and Komatsu，2007)。这两种方式虽然能够有效地去除植物叶片中的Rubisco酶，但均基于免疫学原理，要求抗体特异性非常强，成本较高，一般实验室无法进行。2)肌醇六磷酸沉淀法：利用肌醇六磷酸与不同浓度的Ca²⁺结合作为沉淀介质，在高温孵育的条件下去除叶片中的Rubisco。该方法操作繁琐复杂，且其去除操作需在高温下进行(37℃或42℃)，可能导致其他蛋白质，尤其是一些调控因子和信号因子的降解和损失(Krishnan and Natarajan，2009；李红兵和康振生，2011)。3)高浓度的二硫苏糖醇(DTT)沉淀法(Cho et al.，2008)，其原理和有效性还有待进一步考察和验证。4)聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)是一种常用的用来沉淀蛋白质的水溶性非离子聚合物，不同浓度的PEG沉淀出来的蛋白质不同，在盐浓度和pH值一定的介质中，与蛋白质的等电点和分子量有关。

采用PEG去除植物叶片中Rubisco简便有效，成本低。自Kim et al.(2001)采用不同浓度的PEG对水稻叶片全蛋白进行分馏以除去水稻叶片中Rubisco酶后，15％或16％的PEG很快就被一些研究者广泛运用在水稻叶片低丰度蛋白质组学研究中(Lee et al.，2007；Lee et al.，2010)。然而，由于采用PEG沉淀蛋白质与蛋白质的分子量和等电点有关，不同植物叶片的Rubisco酶分子量和等电点存在一定的差异(柴常星等，1985)，因此，采用15％或者16％PEG去除水稻叶片Rubisco酶的方法并不适用于西瓜叶片上。另外，单子叶植物水稻叶片中含有大量的纤维素和木质素，各个组分和含量与西瓜叶片蛋白质组成均不相同，其所用的酚抽法或丙酮沉淀法抽提剩余蛋白质的方法也不是抽提西瓜叶片蛋白质的最佳方案。因此，本发明试图找到一个去除西瓜叶片Rubisco酶的最佳的PEG浓度，能够简便快速的富集剩余的低丰度蛋白质，并创建了一种适合分离西瓜叶片低丰度蛋白质双向电泳的方法，对于西瓜的抗逆性研究和品质育种有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种去除西瓜叶片Rubisco的方法。

本发明的另一目的是提供一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的双向电泳方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种去除西瓜叶片Rubisco的方法：利用18％(g/100ml，下同)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco。

该方法具体为采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为0.01mm～0.05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比1∶3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4℃下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4℃下于1，5000g，离心20分钟，弃沉淀，保留上清；在上清液中加入18％的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4℃下于1，5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清。